一种合成甘露醇的基因工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术提供一种能够利用果糖合成甘露醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法。利用Crispr/Cas9基因组编辑技术对大肠杆菌K‑12 MG1655的甘露醇磷酸转移酶基因及其IIA、IIB和IIC元件进行敲除，得到大肠杆菌突变体，并通过质粒pTrc99a整合来源于布氏乳杆菌的甘露醇脱氢酶基因，构建重组载体，并实现了其在大肠杆菌突变体中的高效表达，获得重组大肠杆菌，通过发酵技术诱导表达获得甘露醇。利用本发明专利技术方法构建的基因工程菌经发酵培养12h后，使用高效液相色谱进行检测，大肠杆菌具备生产甘露醇的能力，在常温下，甘露醇的产量可达30g/L‑40g/L，有利于甘露醇的工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
一种合成甘露醇的基因工程菌及其构建方法与应用
本专利技术涉及一种合成甘露醇的基因工程菌及其构建方法与应用，属于生物技术和基因工程

技术介绍
D-甘露醇(D-mannitol)，又名己六醇，分子式为C6H14O6，是一种天然的六元糖醇。D-甘露醇广泛存在于植物的根茎叶中，是目前唯一可从植物中提取的具有工业价值的精醇，也是进入人们生活中最早的一种功能性糖醇。由于D-甘露醇具有优良而稳定的性质，所以在医药、化学和食品工业中有着广泛的应用。目前，D-甘露醇的生产方法有海藻提取法、化学氢化法、发酵法和电化学法等。利用发酵法生产D-甘露醇，是利用微生物所产特异性的酶，专一性的催化底物合成D-甘露醇，可有效解决产物特异性差的问题，已发现乳杆菌属(Lactobacillus)、明串珠菌属(Leuconostoc)、酒球菌属(Oencoccus)、球拟酵母(Torulopsis)、假丝酵母(Candida)、青霉(Penicillium)、曲霉(Aspergillus)等微生物均可合成D-甘露醇，其中关于乳酸菌产D-甘露醇的研究较多。其中异型乳酸菌可利用自身的甘露醇脱氢酶(MDH，EC1.1.1.138；EC1.1.1.67)实现以β-NADH或β-NADPH为辅酶将D-果糖转化成D-甘露醇。然而利用异型乳酸菌发酵生产甘露醇，尽管底物果糖的转化率较高，但果糖的成本相对也较高，除乳酸以外的其它副产物也较多，会影响菌体的密度和甘露醇的合成。CRISPR/Cas9是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPRRNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(singleguideRNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。大肠杆菌作为目前研究最透彻的模式生物，由于其遗传背景、代谢机理清晰，遗传操作方法和培养条件成熟、完善，被认为是用来合成基础化学品的非常好的底盘微生物，因此，利用大肠杆菌具有重要的研究意义和工业生产前景。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够利用果糖合成甘露醇的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法。实现本专利技术目的的技术方案概述如下：以大肠杆菌K-12MG1655为出发菌株，通过基本的分子生物学技术手段获得其基因组上的甘露醇磷酸转移酶基因及其IIA、IIB和IIC元件，通过PCR、重叠PCR等构建打靶片段之后，利用Crispr/Cas9基因组编辑技术对大肠杆菌K-12MG1655的甘露醇磷酸转移酶基因及其IIA、IIB和IIC元件进行基因敲除，得到大肠杆菌突变体，并通过质粒pTrc99a整合来源于布氏乳杆菌的甘露醇脱氢酶编码基因，构建重组载体，并实现了其在大肠杆菌突变体中的高效表达，获得重组大肠杆菌。再通过发酵技术诱导表达获得甘露醇。在本专利技术中采用如下定义：1、氨基酸和DNA核酸序列的命名法使用氨基酸残基的公认IUPAC命名法，用三字母代码形式。DNA核酸序列采用公认IUPAC命名法。2、大肠杆菌突变体的标识采用“Δ”来表示大肠杆菌突变体中要敲除的基因。如ΔcmtA，表示要敲除的基因为cmtA。在本专利技术中，小写斜体cmtA表示甘露醇磷酸转移酶编码基因中的IIB和IIC元件，小写斜体cmtB表示甘露醇磷酸转移酶编码基因中的IIA元件，小写斜体mtlA表示甘露醇磷酸转移酶的编码基因3、敲除、敲入的各目标基因的GenebankID如下：进一步地，本专利技术上述基因工程菌的构建方法包括如下步骤：1)以大肠杆菌K-12MG1655为出发菌株，利用Crispr/Cas9基因编辑技术敲除甘露醇磷酸转移酶编码基因中的IIA(GenebankID：945125)、IIB和IIC元件(GenebankID：945256)，获得大肠杆菌突变菌株K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtB)；2)以K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtB)为出发菌株，利用Crispr/Cas9基因编辑技术进一步敲除甘露醇磷酸转移酶编码基因mtlA(GenebankID：948118)，获得大肠杆菌突变菌株K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)；3)以布氏乳杆菌基因组DNA为模板，PCR扩增NADH依赖型的甘露醇脱氢酶基因mdh(NADH)(GenebankID：34323815)，与质粒pTrc99a经相同双酶切后连接，构建重组质粒pTrc99a-mdh(NADH)，转入大肠杆菌K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)，即获得合成甘露醇的重组基因工程菌K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)/pTrc99a-mdh(NADH)。本专利技术还提供上述基因工程菌以果糖为底物合成甘露醇的用途。所述基因工程菌接种于液体LB培养基中，30-37℃、180-220r/min振荡培养过夜，再按2％的接种量接种于液体LB培养基中，30-37℃振荡培养至菌液的OD600值达到0.6-0.8时，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，16℃、160r/min诱导表达10h，离心、收集沉淀，进行超声破碎，向破碎后的细胞破碎液中添加0.8-1.2mol/L果糖作为底物在室温下进行转化合成甘露醇。有益效果：1)本专利技术利用Crispr/Cas9基因组编辑技术对甘露醇磷酸转移酶进行基因敲除，得到阻断甘露醇分解的突变体K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)，cmtA、cmtB、mtlA三个基因全部敲除后，菌株已无法再利用甘露醇作为碳源进行生长，彻底阻断了甘露醇的分解途径。2)本专利技术分别使用了大肠杆菌表达系统、Crispr/Cas9基因组编辑技术，实现突变体不同方式的高效表达。3)本专利技术选择了布氏乳杆菌来源的甘露醇脱氢酶基因，利用基因工程手段，克隆得到了甘露醇脱氢酶基因，应用到大肠杆菌中，本专利技术以敲除甘露醇分解途径中的关键基因并且敲入了甘露醇脱氢酶基因的重组菌为生产菌株，利用本专利技术方法构建的生产甘露醇的基因工程菌经发酵培养12h后，使用高效液相色谱进行检测，大肠杆菌具备生产甘露醇的能力，在常温下，甘露醇的产量可达30g/L-40g/L，是目前已报道的基因工程菌中合成甘露醇能力较高的基因工程菌，有效地促进甘露醇的合成，实现了大肠杆菌中甘露醇产量的积累。本专利技术的基因工程菌大大提高了生物合成甘露醇的产量，有利于甘露醇的工业化生产，具有广阔的应用前景。附图说明图1：菌株K-12MG1655、K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtB)、K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)的生长曲线比较。图2：菌株K-12MG1655、K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtB)、K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtBΔmtlA)利用甘露醇的能本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种合成甘露醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌K‑12MG1655为出发菌株，对其基因组上的甘露醇磷酸转移酶基因及其IIA、IIB和IIC元件进行基因敲除，得到大肠杆菌突变体，并通过质粒pTrc99a整合来源于布氏乳杆菌的甘露醇脱氢酶基因，构建重组载体，并实现了其在大肠杆菌突变体中的高效表达，获得重组大肠杆菌。

【技术特征摘要】
1.一种合成甘露醇的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌K-12MG1655为出发菌株，对其基因组上的甘露醇磷酸转移酶基因及其IIA、IIB和IIC元件进行基因敲除，得到大肠杆菌突变体，并通过质粒pTrc99a整合来源于布氏乳杆菌的甘露醇脱氢酶基因，构建重组载体，并实现了其在大肠杆菌突变体中的高效表达，获得重组大肠杆菌。2.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述甘露醇磷酸转移酶基因及其IIA、IIB和IIC元件包括：GenebankID：945125的IIA元件、GenebankID：945256的IIB和IIC元件、以及GenebankID：948118的甘露醇磷酸转移酶编码基因mtlA。3.如权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述甘露醇脱氢酶码基因为NADH依赖型的甘露醇脱氢酶基因mdh(NADH)，GenebankID：34323815。4.权利要求1或2或3所述基因工程菌的构建方法，包括如下步骤：1)以大肠杆菌K-12MG1655为出发菌株，利用Crispr/Cas9基因编辑技术敲除其基因组上的甘露醇磷酸转移酶基因的IIA、IIB和IIC元件，获得大肠杆菌突变菌株K-12MG1655(ΔcmtAΔcmtB)；2)以K-12MG1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李玉，赵雅童，石爱琴，王洪彬，秦惠民，刘逸寒，刘夫锋，路福平，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津,12