一种利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法技术

本发明专利技术公开了一种端粒酶活性检测方法，包括：利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶；利用捕获探针和端粒酶进行延伸反应，反应产物与信号探针溶液进行杂交反应；用超分辨成像技术对杂交反应产物进行检测。本发明专利技术采用超分辨成像技术能够检测到低浓度端粒酶形成的微弱信号，实现了更高灵敏度的端粒酶活性检测；采用Cy5染料修饰的端粒互补序列DNA作为信号探针，获得更高分辨率的图像及更低的检测限；避免了PCR反应过程以及信号扩增过程，大大简化了端粒酶活性检测步骤，同时也提高了检测结果的可靠性。

【技术实现步骤摘要】
一种利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法
本专利技术涉及端粒酶活性检测领域，涉及检测端粒酶活性方法，更为具体的说是涉及一种具体是通过超分辨成像技术检测端粒酶活性的方法。
技术介绍
端粒是存在于真核细胞线状染色体末端的一种特殊结构。端粒和端粒结合蛋白一起在染色体末端形成“帽状”结构，维持染色体的完整和细胞活性。端粒会随着细胞的不断分裂而缩短，这会严重影响细胞的增殖，最终导致细胞凋亡。端粒酶是一种由RNA和蛋白组成的核糖核蛋白，能在染色体末端不断合成端粒序列，从而在细胞分裂过程中维持端粒的长度。正常体细胞中的端粒酶的活性被抑制，然而85％以上的肿瘤细胞显端粒酶活性，因此端粒酶与肿瘤的发生有着密切的关系。端粒酶不仅可以作为癌症早期诊断依据和预后指标，还能够成为癌症治疗的有效靶点。因此，对于端粒酶结构、功能、活性及作用机理的研究具有实际应用价值。端粒酶的检测方法主要可分为直接引物延伸法和端粒重复序列扩增法(telomericrepeatamplificationprotocol，TRAP)两类。其中端粒重复序列扩增法通过PCR扩增端粒酶合成的端粒序列，由于扩增过程受许多因素影响，在提高检测灵敏度的同时容易造成假阴性的结果。此外还有比色法、化学发光法、表面等离子激元共振法、荧光共振能量转移法等避免了PCR过程的检测端粒酶的方法，他们或多多少存在一些诸如检测灵敏度不够，过程复杂的缺点。因此，具有低检测限，高灵敏度，检测过程简便的端粒酶检测方法亟待提出。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术公开了一种端粒酶活性检测方法，利用超分辨成像超越衍射极限的高空间分辨率能够检测低浓度的端粒酶活性，且无需复杂的信号扩增步骤。为了达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，包括如下步骤：第一步，利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶；第二步，利用捕获探针和端粒酶进行延伸反应，反应产物与信号探针溶液进行杂交反应；所述的捕获探针为掺杂染料的二氧化硅纳米球表面修饰端粒酶底物；所述的信号探针为修饰了染料分子的端粒互补序列；第三步，用超分辨成像技术对杂交反应产物进行检测，根据获得的两个通道的图像上点的重合情况以及DNA探针的荧光信号所获得的图像上点的大小判断端粒酶的活性。信号探针的荧光越强，说明端粒酶活性越高。进一步的，所述第二步中延伸反应步骤为：取200-300μL捕获探针，与5μL10mMdNTPs、1-2μLRNA酶抑制剂、5μL第一步中得到的端粒酶提取物混合，于30℃下振荡1-2小时进行端粒延伸反应；所述反应产物与信号探针的杂交反应步骤包括：延伸反应产物以2500-3000转，15分钟离心提纯1次；去除上清后，将沉淀分散至200-300μL的PBS溶液中，再加入0.3-0.9μL10μM的信号探针进行杂交反应；该混合液30℃振荡2-3小时，以2500g，15min离心提纯，去除上清液，将杂交产物的沉淀分散至500-800μLPBS中。进一步的，所述捕获探针的制备方法包括如下步骤：配制10mMEDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和10mMNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，取10-20μL10μMTSPrimer(端粒酶引物，序列为5'-COOH-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3')溶于PBS溶液中，再分别加入10-20μLEDC溶液和10-20μLNHS溶液，加入50-60μL掺杂FITC(异硫氰酸荧光素)的二氧化硅纳米球溶液，置于摇床中振荡反应12-16小时；将反应物以2500-4000转，15分钟离心1-2次提纯；去除上清，沉淀分散于2mLPBS溶液中，即得到捕获探针。进一步的，所述掺杂FITC的二氧化硅纳米球的制备方法包括如下步骤：在1mL无水乙醇中加入0.5-1mgFITC粉末和50-100μL的APTMS(3-氨丙基三甲氧基硅烷)，涡旋搅拌均匀后于摇床中振荡反应6-8小时后获得FITC-APTMS(偶联了APTMS的FITC)，该产物保存于4℃待用；之后，在50mL无水乙醇中加入1-1.5mL去离子水，1.5-2mL98％TEOS(正硅酸四乙酯)和100-120μL的FITC-APTMS，在缓慢搅拌的条件下滴入3-3.5mL25％氨水，反应3-3.5小时后加入1mL98％TEOS，继续反应三小时；将反应产物以3000-5000转，15分钟离心3-5次；每次离心后去除上清，将沉淀分散至3mL无水乙醇中，避光保存。进一步的，所述信号探针为5'-Cy5-CCCTAACCCTAA-3'。进一步的，所述信号探针的制备方法包括：将5'端修饰了Cy5染料的端粒互补序列的粉末离心后加入PBS溶液即获得10μM的DNA探针溶液。进一步的，所述第一步具体包括如下过程：将1×106个对数生长期的细胞用冰PBS缓冲液离心清洗若干次后分散至100μLRNA酶抑制剂处理过的冰镇CHAPS裂解液中，冰上孵育一段时间后，将裂解液以12000rpm，20min离心，取出上清即得端粒酶提取物。进一步的，所述端粒酶引物序列为5'-COOH-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3'。与现有技术相比，本专利技术具有如下优点和有益效果：1、本专利技术采用超分辨成像技术能够检测到低浓度端粒酶形成的微弱信号，实现了更高灵敏度的端粒酶活性检测。2、本专利技术采用Cy5染料修饰的端粒互补序列DNA作为信号探针，Cy5本身就具有进行超分辨成像所需的闪烁特性，信号探针与目标DNA链的可逆杂交及解离过程可以实现单分子定位成像，从而获得更高分辨率的图像及更低的检测限。3、本专利技术方法避免了PCR反应过程以及信号扩增过程，大大简化了端粒酶活性检测步骤，同时也提高了检测结果的可靠性。附图说明图1是本专利技术提出的端粒酶活性检测方法示意图；图2是实施例1中样品的显微成像图，其中(a)、(b)为有端粒酶的样品分别在在绿色(FITC)荧光通道和红色(Cy5)荧光通道中检测到的荧光信号，(c)、(d)为无端粒酶的样品分别在在绿色(FITC)荧光通道和红色(Cy5)荧光通道中检测到的荧光信号；FITC：掺染料的二氧化硅纳米球荧光通道；Cy5：信号探针的荧光通道。具体实施方式以下将结合具体实施例对本专利技术提供的技术方案进行详细说明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。本专利技术采用基于单分子定位(SMLM)的超分辨光学成像技术对端粒酶延伸反应的产物进行检测。利用超分辨率成像的端粒酶活性检测方法无需PCR过程，超分辨率成像突破衍射极限的分辨率，使得这个方法的检测灵敏度明显高于其它方法。本专利技术方法主要步骤如下：第一步，利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶；第二步，利用捕获探针和端粒酶进行延伸反应，反应产物与信号探针溶液进行杂交反应；所述的捕获探针为掺杂染料的二氧化硅纳米球表面修饰端粒酶底物；所述的信号探针为修饰了染料分子的端粒互补序列；第三步，用超分辨成像技术对杂交反应产物进行检测。当样品中有端粒酶时，端粒酶将在端粒酶底物上合成并延伸出端粒序列，该序列与Cy5修饰的DNA信号探针杂交，使DNA探针被捕获，清洗后进行成像，在成像时可以分别在两个不同的通道检测到属于二氧化硅纳米球和DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶；第二步，利用捕获探针和端粒酶进行延伸反应，反应产物与信号探针溶液进行杂交反应；所述的捕获探针为掺杂染料的二氧化硅纳米球表面修饰端粒酶底物；所述的信号探针为修饰了染料分子的端粒互补序列；第三步，用超分辨成像技术对杂交反应产物进行检测，根据获得的两个通道的图像上点的重合情况以及DNA探针的荧光信号所获得的图像上点的大小判断端粒酶的活性。

【技术特征摘要】
1.一种利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，其特征在于，包括如下步骤：第一步，利用CHAPS法提取待测细胞中的端粒酶；第二步，利用捕获探针和端粒酶进行延伸反应，反应产物与信号探针溶液进行杂交反应；所述的捕获探针为掺杂染料的二氧化硅纳米球表面修饰端粒酶底物；所述的信号探针为修饰了染料分子的端粒互补序列；第三步，用超分辨成像技术对杂交反应产物进行检测，根据获得的两个通道的图像上点的重合情况以及DNA探针的荧光信号所获得的图像上点的大小判断端粒酶的活性。2.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述第二步中延伸反应步骤为：取200-300μL捕获探针，与5μL10mMdNTPs、1-2μLRNA酶抑制剂、5μL第一步中得到的端粒酶提取物混合，于30℃下振荡1-2小时进行端粒延伸反应；所述反应产物与信号探针的杂交反应步骤包括：延伸反应产物以2500-3000转，15分钟离心提纯1次；去除上清后，将沉淀分散至200-300μL的PBS溶液中，再加入0.3-0.9μL10μM的信号探针进行杂交反应；该混合液30℃振荡2-3小时，以2500g，15min离心提纯，去除上清液，将杂交产物的沉淀分散至500-800μLPBS中。3.根据权利要求1所述的利用超分辨成像检测端粒酶活性的方法，其特征在于，所述捕获探针的制备方法包括如下步骤：配制10mMEDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)溶液和10mMNHS(N-羟基琥珀酰亚胺)溶液，取10-20μL10μMTSPrimer(端粒酶引物，序列为5'-COOH-TTTTTTTTTTAATCCGTCGAGCAGAGTT-3')溶于PBS溶液中，再分别加入10-20μLEDC溶液和10-20μLNHS溶液，加入50-60μL掺杂FITC(异硫氰酸荧光素)的二氧化硅纳米球溶液，置于摇床中振荡反应12-16小时；将反应物以2500-4...

【专利技术属性】
技术研发人员：宗慎飞，宗君珠，王著元，崔一平，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32