用于测序的底物和方法技术

本发明专利技术提供了一种水凝胶网络，所述水凝胶网络包括具有偶联位点的水凝胶聚合物、在末端处缀合到所述水凝胶聚合物的所述偶联位点的寡核苷酸以及偶联于所述寡核苷酸的所述末端和所述偶联位点之间的官能部分。此类水凝胶网络能够通过以下方法形成：活化底物的偶联位点，以及使与寡核苷酸的末端偶联的连接基部分键合到所述活化的偶联位点，官能部分偶联于所述寡核苷酸的所述末端和所述连接基部分之间。

Substrates and methods for sequencing

The invention provides a hydrogel network, which includes a hydrogel polymer with coupling sites, oligonucleotides that are conjugated at the end to the coupling site of the hydrogel polymer, and a functional part coupled to the terminus of the oligonucleotide and the coupling site. This kind of hydrogel network can be formed by the following methods: the coupling site of the activated substrate, and the bonding group coupled with the end of the oligonucleotide to the activated coupling site, and the functional part is partially coupled to the terminus of the oligonucleotide and the connection base portion.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测序的底物和方法相关申请的交叉引用本专利申请要求2015年7月6日提交的美国临时专利申请No.62/189,019的利益，该临时专利申请全文以引用方式并入本文。
本公开整体涉及用于测序及相关应用的离散的聚合物网络底物、用于制备此类离散的聚合物网络的方法以及使用此类离散的聚合物网络的方法。
技术介绍
医学和科学界对基因检测越来越感兴趣。在医学上，基因检测提供了有关疾病起源、疾病易感性、药物反应性和遗传性状鉴定的详细信息。除使用基因检测对物种进行分类并确定迁徙模式以外，动物科学还希望通过基因检测提供类似的详细信息。在其它领域诸如农业科学中，利用基因检测鉴定可掺入动植物品系中的基因序列，以降低对病虫害的易感性并提高产量。尽管已经提出了许多基因检测技术，但是当前的基因检测技术依赖于设置在例如可用于检测核苷酸掺入的装置(诸如光学装置或离子敏感装置)上的离散的核酸缀合的聚合物网络。在一个具体示例中，离散的缀合网络可沉积到设置在离子敏感场效应晶体管上的孔中，该离子敏感场效应晶体管测量由核苷酸掺入而释放的焦磷酸盐或氢离子。其它技术依赖于设置在不含孔的底物上的离散网络的阵列。附图说明通过参考附图，本公开内容可得到更好理解，并且其众多特征和优点对于本领域技术人员变得显而易见。图1包括示出用于制备寡核苷酸的示例性方法的流程图。图2示出用于制备寡核苷酸的示例性方法。图3和图4包括示例性染料标记的核苷酸的图示。图5包括示例性染料标记的寡核苷酸的图示。图6包括用于制备寡核苷酸的示例性方法的图示。图7包括示出用于制备和利用缀合至寡核苷酸的底物的示例性方法的流程图。图8包括示出用于制备和使用缀合至核酸的底物的示例性方法的流程图。图9包括用于制备在测序装置中使用的离散底物的示例性乳液基方法的图示。图10包括示例性测序系统的图示。不同附图中使用的相同参考符号指示相似或相同的项目。具体实施方式在一个示例性实施方案中，底物可包括缀合至底物的偶联位点的寡核苷酸或核酸。一部分可附接至掺入寡核苷酸或核酸中的经修饰的核苷酸。例如，所述部分可通过与碱基的连接键附接至核苷酸，其中连接键附接至嘧啶碱基诸如胸苷和胞苷的5位上，或者其中连接键附接至7-脱氮嘌呤碱基诸如鸟苷和腺苷的7位上。所述部分可附接至偶联于寡核苷酸或核酸的末端的经修饰的核苷酸或者可固定于寡核苷酸或核酸的任何碱基位置。在一个具体实施例中，所述部分为染料部分，诸如TAMRA染料或荧光素染料。在另一实施例中，官能部分用作缓冲剂。在另一实施例中，一部分可附接至固定于寡核苷酸或核酸的末端和底物的偶联位点之间的非核苷酸结构。在一个实施例中，底物为离散底物，例如包括水凝胶网络(诸如聚丙烯酰胺网络)。在一个具体实施例中，染料部分偶联至寡核苷酸或核酸的末端的核苷酸类似物，例如偶联于寡核苷酸或核酸的末端和偶联位点之间。在另一实施例中，此类具有偶联至偶联位点的经染料修饰的寡核苷酸的离散底物特别适用于制备包括核酸的克隆群体的离散底物，并且例如可用于测序或定量扩增。在图1中所示的示例性实施方案中，方法100包括生成寡核苷酸，如102所示。在一个具体实施例中，寡核苷酸可利用亚磷酰胺化学作用生成并且在底物上合成。例如，如图2所示，寡核苷酸的末端碱基可被脱保护(202)，例如通过脱三苯甲基以提供5'羟基。可在存在酸性唑类催化剂诸如四唑、2-乙硫基四唑、2-苄硫基四唑、4,5-二氰基咪唑或它们的组合的情况下加入经亚磷酰胺修饰的核苷酸(204)以取代5'羟基。所得的亚磷酸盐可被氧化(206)为磷酸盐，并且重复该过程。虽然图2的方法示出经氰基醚修饰的亚磷酰胺或DMT保护的5'羟基，但是在过程中可利用类似的保护化学基团以生成寡核苷酸。包括官能部分的经修饰的核苷酸可附接至寡核苷酸或核酸的末端，如104所示。具体地，经修饰的核苷酸可附接至寡核苷酸的5'端的近侧。在一个具体实施例中，经修饰的核苷酸可包括偶联于经修饰的碱基并且使用与上文所述类似的亚磷酰胺化学基团加入寡核苷酸的5'端的部分。附加的连接基部分可偶联至寡核苷酸末端的近侧，诸如附接至其中偶联官能部分的经修饰的碱基。具体地，例如，经修饰的核苷酸的5'羟基可被脱保护，并且连接基部分可偶联于脱保护的5'羟基。在另一实施例中，经修饰的核苷酸可固定到寡核苷酸或核酸内的任何碱基位置。另选地，包括官能部分的非核苷酸结构可固定到寡核苷酸的末端。在一个具体实施例中，官能部分可通过使用标记的亚磷酰胺掺入寡核苷酸中，其中官能部分在固相合成寡核苷酸的过程中掺入。在另一实施例中，所述部分可在对寡核苷酸脱保护并且将其从固相载体上裂解后掺入。例如，所述部分可沿寡核苷酸结构的点处掺入，其中反应基团(诸如受保护的胺)通过嘧啶碱基诸如胸苷和胞苷的5位的连接键附接至核苷酸亚磷酰胺，或者其中连接键附接至7-脱氮嘌呤碱基诸如鸟苷和腺苷的7位上。在另一实施例中，所述部分可在掺入非核苷酸结构中的受保护的胺处掺入。在裂解和脱保护包含脱保护的反应基团的寡核苷酸后，寡核苷酸可与附接至官能部分的反应基团反应，该反应基团与寡核苷酸上的反应基团相容。例如，当寡核苷酸上的反应基团为胺时，反应部分可为官能部分的NHS酯。在一个实施例中，官能部分包括染料部分。例如，染料部分可为罗丹明染料。在另一实施例中，染料部分可为5-羟基四甲基罗丹明、四甲基罗丹明(TAMRA)炔烃或它们的变型形式。例如，如图3所示，经修饰的胸腺嘧啶或尿苷核苷酸包括偶联的染料部分。图3示出附接于胸腺嘧啶亚磷酰胺的示例性TAMRA染料部分。在另一实施例中，染料部分可为荧光素染料。例如，荧光素染料可为二新戊酰基荧光素染料，诸如5-二甲氧基三苯甲基氧基-5-[N-(3',6'-二新戊酰基荧光素基)-氨基]染料。示例性染料为Alexa染料。图4示出示例性经荧光素修饰的胸腺嘧啶核苷酸。在另一实施例中，官能部分可为缓冲部分。示例性缓冲部分可具有可测定的pKa，其可共价连接或整合到核苷酸亚磷酰胺或其它亚磷酰胺非核苷酸结构。缓冲部分及其可作为部分连接或整合的结构的示例包括N-(3-吗啉基-4-基丙基，三乙醇胺：N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸：3-(N-三[羟甲基]甲氨基)-2-羟基丙磺酸：N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)：N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸：咪唑：以及乙酸盐：或它们的任何组合。缓冲部分也可根据缓冲部分预定的pKa来选择。例如，溶液相缓冲基团的预定pKa值可包括从约4.5至约9.0的范围，例如约6.0至约8.0。仅以举例的方式，缓冲基团的预定pKa值可被选择为约4.76、约6.8、约6.9、约7.5、约7.6以及约7.8。此类经修饰的亚磷酰胺核苷酸可掺入寡核苷酸的末端。具体地，如图5所示，寡核苷酸引物序列可附接至经染料修饰的核苷酸，诸如胸腺嘧啶核苷酸，并且反应末端基团W可由连接基附接至经修饰的核苷酸。任选地，寡核苷酸引物序列的末端核苷酸可经聚乙二醇(PEG)修饰，随后经染料修饰的核苷酸可附接至该末端。返回图1，在形成经染料修饰的寡核苷酸后，可洗涤寡核苷酸，如106所示。例如，可洗涤寡核苷酸以除去反应副产物。此外，可使用碱洗涤除去保护部分，诸如酯部分(例如，保护磷酸盐的氧的氰基酯部分)。另外，寡核苷酸可进行离子交换，如108所示，以本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种形成核酸底物的方法，所述方法包括：活化底物的偶联位点；以及使与寡核苷酸的末端偶联的连接基部分键合到所述活化的偶联位点，官能部分偶联于所述寡核苷酸的所述末端和所述连接基部分之间。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.07.06 US 62/189,0191.一种形成核酸底物的方法，所述方法包括：活化底物的偶联位点；以及使与寡核苷酸的末端偶联的连接基部分键合到所述活化的偶联位点，官能部分偶联于所述寡核苷酸的所述末端和所述连接基部分之间。2.一种对核酸靶标进行测序的方法，所述方法包括：将离散的底物施加于测序装置，所述离散的底物在所述离散的底物的偶联位点处缀合到所述核酸靶标的末端，官能部分偶联于所述核酸的所述末端和所述底物之间；施加与所述靶核酸的一部分互补的引物；使核苷酸流入所述测序装置中；以及检测与所述核苷酸相关联的掺入事件。3.一种形成核酸底物的方法，所述方法包括：在一定条件下使缀合至寡核苷酸偶联位点的底物暴露于酶、核苷酸以及与所述寡核苷酸的至少一部分互补的靶多核苷酸以促进寡核苷酸的延伸，官能部分键合于所述寡核苷酸和所述偶联位点之间；以及在所述寡核苷酸的延伸之后洗涤所述底物。4.根据权利要求3所述的方法，其中暴露所述底物在乳液中执行。5.根据权利要求4所述的方法，还包括在洗涤之前破乳以回收所述底物。6.根据权利要求5所述的方法，还包括富集所述底物以使所述底物与未扩增的底物分离。7.根据权利要求6所述的方法，还包括使所述底物沉积到测序装置上。8.根据权利要求7所述的方法，还包括对所述延伸的寡核苷酸进行测序。9.根据权利要求3所述的方法，其中所述末端为所述寡核苷酸的所述5'端。10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述末端为所述寡核苷酸的所述5'端。11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，还包括对所述寡核苷酸进行离子交换。12.根据权利要求1-11中任一项所述的方法，其中所述官能部分为染料部分。13.根据权利要求12所述的方法，其中所述染料部分为罗丹明部分。14.根据权利要求12所述的方法，其中所述染料部分为荧光素部分。15.根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述官能部分为缓冲部分。16.根据权利要求15所述的方法，其中所述缓冲部分为吗啉基烷基、三乙醇胺、N-[三(羟甲基)甲基]-2-氨基乙磺酸、3-(N-三[羟甲基]甲氨基)-2-羟基丙磺酸、N-(2-羟乙基)哌嗪-N-(2-乙磺酸)、N-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸、咪唑、乙酸盐或它们的任何组合。17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述官能部分附接至经修饰的核苷酸。18.根据权利要求17所述的方法，其中所述经修饰的核苷酸包括嘧啶碱基，所述官能部分偶联到所述嘧啶碱基。19.根据权利要求18所述的方法，其中所述官能部分附接至所述嘧啶碱基的所述5位。20.根据权利要求18所述的方法，其中所述嘧啶碱基包括胸苷或胞苷。21.根据权利要求17所述的方法，其中所述经修饰的核苷酸包括7-脱氮嘌呤碱基。22.根据权利要求21所述的方法，其中所述官能部分附接至所述7-脱氮嘌呤碱基的所述7位...

【专利技术属性】
技术研发人员：SM门彻，G项，PK特瓦尔，J弗雷迪亚尼，A王，A吕，L卢，
申请(专利权)人：生命技术公司，
类型：发明
国别省市：美国,US