一种恒温固相重组杂交方法技术

本发明专利技术公开一种恒温固相重组杂交方法，所述重组杂交方法包括以下步骤：(1)用标记引物扩增待测靶标核酸序列，产生标记双链靶标核酸；(2)将单链DNA探针嵌入或者吸附于固相介质表面，所述探针包含与待检测的标记双链靶标核酸序列互补的核酸序列；(3)水化步骤(2)中的固相介质表面，释放探针；(4)使探针与靶标核酸发生特异性重组杂交；(5)去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增核酸产物；(6)加入针对靶标核酸标记物的结合物‑呈色剂复合体，结合相应的标记靶标核酸并呈色；(7)根据呈色情况检测样品中是否含有靶标核酸。本发明专利技术的重组杂交方法大幅减少了操作时间、步骤和复杂度。

A method of solid phase recombination at constant temperature

The invention discloses a constant temperature solid phase recombination hybridization method, which comprises the following steps: (1) amplification of the target nucleic acid sequence with marked primers, producing a labeled double chain target nucleic acid, and (2) embedding a single strand DNA probe into or adsorbing on the surface of the solid medium, and the probe includes a labeled double chain target. Nucleic acid sequences complementary to nucleic acid sequences; (3) the surface of the solid medium in the hydration process (2), the release of the probe; (4) the specific recombination hybridization between the probe and target nucleic acid; (5) the removal of the unhybrid or non specific hybridization amplification of nucleic acid products; (6) the combination of the conjugate of a needle against the target nucleic acid marker The corresponding labeled target nucleic acids and their coloring are combined; (7) whether the target nucleic acid is detected in the sample according to the color rendering condition. The recombination hybridization method of the invention greatly reduces operation time, steps and complexity.

【技术实现步骤摘要】
一种恒温固相重组杂交方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种恒温固相重组杂交方法。
技术介绍
杂交技术被广泛应用于实验室研究和医疗诊断中，成功的杂交程序至少部分依赖于所使用的探针处于适当的、精确测量的浓度。当杂交反应处于一种不适当的条件下，不准确的结果包括假阳性或者假阴性会频繁发生。标准的杂交程序通常包括以下几个步骤：(a)95℃高温使核苷酸探针变性。(b)在冰上激冷以防止探针退火。(c)在温度范围55-62℃过夜杂交(SambrookandRussell,supra；Ausubeletal.,supra.SeealsoTijssen,LaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology,Vol.24:HybridizationwithNucleicAcidProbes(Elsevier,NY1993))。典型的杂交反应需要消耗时间以及大量的人工。并且，根据探针序列的不同杂交温度必须优化，前者往往依赖于存在于靶标基因序列的胞嘧啶和鸟嘌呤的百分比。这种温度的优化发生于每种分析用的探针，需要大量的尝试和误差测试。对于实施多重靶点同时杂交检测，这种方法就非常困难。有鉴于此，发展一种简单可靠、不需要消耗时间和复杂步骤的杂交方法成为必须，这里我们专利技术了一种新的重组杂交方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足而提供一种恒温固相重组杂交方法，大幅减少了操作时间、步骤和复杂度，可以在固相表面方便快速地决定靶点核酸是否存在于检测样品中。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种恒温固相重组杂交方法，包括以下步骤：(1)用标记引物扩增待测靶标核酸序列，产生标记双链靶标核酸；(2)将单链DNA探针嵌入或者吸附于固相介质表面，所述探针包含与待检测的标记双链靶标核酸序列互补的核酸序列；(3)水化步骤(2)中的固相介质表面，释放探针；(4)将步骤(1)中扩增的标记双链靶标核酸与含有重组酶的恒温杂交缓冲液在固相介质表面共孵育，使探针与靶标核酸发生特异性重组杂交；(5)去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增核酸产物；(6)加入针对靶标核酸标记物的结合物-呈色剂复合体，结合相应的标记靶标核酸并呈色；(7)根据呈色情况检测样品中是否含有靶标核酸。上述技术方案提供的恒温杂交方法可以在固相表面方便快速地决定靶点核酸是否存在于检测样品中。目前常规应用的温度依赖型杂交方法中，需要升温变性、降温退火、配对杂交等复杂过程，通常需要耗时3个小时以上。在进行多重或者大量目标同时检测时，每一个探针的长度需要进行反复测试以保证杂交温度一致，最终的杂交效果难以保证。该专利技术的重组杂交方法大幅减少了操作时间、步骤和复杂度，其要点在于，该专利技术中使用的重组酶能够迅速解开双链DNA，并且在基于同源重组的原理上特异性地将探针与靶标DNA序列配对，这样就允许核酸杂交反应在宽恒温条件(40±2℃)下发生于每一个序列形态的探针，这可以避免为每一个检测的探针优化杂交温度，从而可以非常容易地同时进行大量靶标的杂交检测，整个反应时间可以在20-25分钟内完成。作为本专利技术所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，采用多聚酶链式反应或恒温核酸扩增法扩增待测靶标核酸序列。作为本专利技术所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述固相介质包括塑料板、玻璃片或硝酸纤维素膜。作为本专利技术所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述固相介质表面包括鲑鱼精子DNA、封闭剂和抗菌剂中的至少一种。作为本专利技术所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，采用水化溶液水化步骤(2)中的固相介质表面，所述水化溶液由下述浓度的组分构成：硫酸葡聚糖10～20wt％和PBS缓冲液10mM。作为本专利技术所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述探针为DNA寡核苷酸探针。作为本专利技术所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述DNA寡核苷酸探针的长度为20～50nt且在5’端带有60个多聚T核苷酸；所述DNA寡核苷酸探针经254nm紫外线辐照10min，辐照强度为0.3J/cm2，固化在固相介质表面。作为本专利技术所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述标记物包括生物素、地高辛或荧光染料。作为本专利技术所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述杂交缓冲液包括重组酶和PBS缓冲液，所述杂交缓冲液pH值为7.5，温度为40±2℃。作为本专利技术所述的恒温固相重组杂交方法的优选实施方式，所述结合物包括链霉亲和素、抗地高辛或荧光染料的抗体；呈色剂包括胶乳或胶体金。与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：本专利技术的重组杂交方法大幅减少了操作时间、步骤和复杂度。本专利技术通过使用重组酶能够迅速解开双链DNA，并且在基于同源重组的原理上特异性地将探针与靶标DNA序列配对，这样就允许核酸杂交反应在宽恒温条件(40±2℃)下发生于每一个序列形态的探针，这可以避免为每一个检测的探针优化杂交温度，从而可以非常容易地同时进行大量靶标的杂交检测，整个反应时间可以在20-25分钟内完成。附图说明图1为本专利技术重组酶恒温杂交反应流程原理示意图。这里重组酶与单链DNA探针相互作用形成单链DNA探针-重组酶复合体，然后扫描标记双链靶标核酸序列并帮助探针结合靶标序列，同时也以同源重组方式替换掉非模板链。图2为本专利技术一个实施案例示意图:(a)整个芯片布局了3个靶标基因(ERBB2,EGFRandAKT2)的检测。(b)靶标基因(ERBB2,EGFRandAKT2)被恒温杂交检测显示阳性结果的案例。(c)特异性单链DNA探针被固定在固相介质上的案例。图3为本专利技术一个实施方案流程图:(a)单链DNA探针被嵌入或者吸附于固相介质表面；(b)用单侧标记引物扩增待检测靶标核酸序列；(c,d)水化并加入含有重组酶的恒温杂交缓冲液，进行恒温杂交；(e,f)漂洗介质表面以去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增DNA产物，并将针对靶标核酸产物标记物的结合(抗体)-呈色剂复合体加到固相表面以结合相应的标记靶标核酸并呈色。图4为本专利技术的一个实施案例结果图。具体实施方式为更好地说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。图1为本专利技术重组酶恒温杂交反应流程原理示意图。本专利技术提供一种恒温固相重组杂交方法，包括以下步骤：(1)用标记引物扩增待测靶标核酸序列，产生标记双链靶标核酸；(2)将单链DNA探针嵌入或者吸附于固相介质表面，所述探针包含与待检测的标记双链靶标核酸序列互补的核酸序列；(3)水化步骤(2)中的固相介质表面，释放探针；(4)将步骤(1)中扩增的标记双链靶标核酸与含有重组酶的恒温杂交缓冲液在固相介质表面共孵育，使探针与靶标核酸发生特异性重组杂交；(5)去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增核酸产物；(6)加入针对靶标核酸标记物的结合物-呈色剂复合体，结合相应的标记靶标核酸并呈色；(7)根据呈色情况检测样品中是否含有靶标核酸。在将非结合的物本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种恒温固相重组杂交方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用标记引物扩增待测靶标核酸序列，产生标记双链靶标核酸；(2)将单链DNA探针嵌入或者吸附于固相介质表面，所述探针包含与待检测的标记双链靶标核酸序列互补的核酸序列；(3)水化步骤(2)中的固相介质表面，释放探针；(4)将步骤(1)中扩增的标记双链靶标核酸与含有重组酶的恒温杂交缓冲液在固相介质表面共孵育，使探针与靶标核酸发生特异性重组杂交；(5)去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增核酸产物；(6)加入针对靶标核酸标记物的结合物‑呈色剂复合体，结合相应的标记靶标核酸并呈色；(7)根据呈色情况检测样品中是否含有靶标核酸。

【技术特征摘要】
1.一种恒温固相重组杂交方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)用标记引物扩增待测靶标核酸序列，产生标记双链靶标核酸；(2)将单链DNA探针嵌入或者吸附于固相介质表面，所述探针包含与待检测的标记双链靶标核酸序列互补的核酸序列；(3)水化步骤(2)中的固相介质表面，释放探针；(4)将步骤(1)中扩增的标记双链靶标核酸与含有重组酶的恒温杂交缓冲液在固相介质表面共孵育，使探针与靶标核酸发生特异性重组杂交；(5)去除未杂交的或者非特异性杂交的扩增核酸产物；(6)加入针对靶标核酸标记物的结合物-呈色剂复合体，结合相应的标记靶标核酸并呈色；(7)根据呈色情况检测样品中是否含有靶标核酸。2.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述步骤(1)中，采用多聚酶链式反应或恒温核酸扩增法扩增待测靶标核酸序列。3.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述固相介质包括塑料板、玻璃片或硝酸纤维素膜。4.根据权利要求1所述的恒温固相重组杂交方法，其特征在于，所述固相介质表面包括鲑鱼精子DNA、封闭剂和抗菌剂中...

【专利技术属性】
技术研发人员：张睿，李博安，詹尔昌，
申请(专利权)人：博迪泰厦门生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：福建,35