【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物检测，具体涉及一种基于crispr/cas13a结合非靶向循环指数扩增的检测方法及其应用。
技术介绍
1、新型冠状病毒(covid-19)是由一种新型人类冠状病毒(sars-cov-2)所引起的急性呼吸道传染病，以发热、干咳、乏力等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状，严重情况下可能导致人休克甚至死亡。因此，设计开发针对新冠病毒的快速有效、灵敏度高、特异性好的检测方法，提高新冠筛查速度，减少诊断错误，具有重要意义。
2、目前，检测新冠有逆转录定量聚合酶链式反应(rt-qpcr)、胸部x光片(cxr)、ct扫描等传统方法。rt-qpcr方法具有灵敏度高和特异性强的优点，但rt-qpcr检测耗时较长，容易出现假阳性，同时还需要大型的仪器设备和专业的技术人员。胸部x光片(cxr)和ct扫描是常见的诊断放射学检查方法，可以很好地对新冠进行辅助诊断，但ct扫描仪价格昂贵，因此ct成像不易获得。而cxr系统相对ct扫描仪较为便宜，但是cxr成像的不足是判断患者是否感染新型时，放射科医生的经验起着至关重要的作用，依赖于人为主观因素。
3、近十年来，crispr技术迅速发展，不仅可用于基因编辑的工具种类日渐繁多，而且其应用范围也逐步扩大，涵盖了基因编辑、核酸检测及基因治疗等领域。crispr-cas系统通常可分为两类：第1类系统是多蛋白效应复合物，包括i、iii和iv型。第2类系统是单一效应蛋白，包括ii型、v型和vi型。通常crispr/cas系统在检测上的应用是基于第2类c
4、随着等温核酸扩增技术的快速发展，包括重组酶聚合酶扩增(rpa)、环介导等温扩增(lamp)、重组酶介导等温扩增(raa)等技术可与实时荧光系统结合，在较短时间内呈现检测结果。此外，将等温扩增技术与crispr-cas系统结合可改善核酸检测效率。这种结合优势体现在通过核酸扩增可以将目标核酸片段进行大量扩增，进而提高检测的灵敏度，使得即使在低拷贝数的样本中也能进行准确的检测。但缺点在于预扩增模式依赖于靶序列的复制，并且引物设计难度复杂。
技术实现思路
1、本专利技术的目的在于针对现有技术的不足而提供一种基于crispr/cas13a结合非靶向循环指数扩增的检测方法及其应用，以解决现有等温扩增结合crispr检测系统采用的预扩增模式中，扩增单元的设计须根据目标进行调制、序列设计难度大等问题。本专利技术采用的后置扩增放大策略序列经过筛选优化，具有操作简便，特异性强，检测时间短等优点，可以扩展应用到其他rna靶标的检测中。
2、首先与待测靶标核酸序列互补的三组cas13a crrna分别引导lwacas13a特异性结合靶标核酸序列形成三元复合物，激活cas13a反式切割活性，切割级联探针中的blockerrna，释放出的trigger dna与预先设计的template结合，可以激活非靶向循环指数扩增，获得的产物intrusion strand可以将fam-bhq1-probe中的bhq1链置换下来，产生可检测的荧光信号。当靶标不存在时，过量的blocker rna牢牢锁住trigger dna，无法激活扩增反应，不会引起荧光信号的显著变化。
3、本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一种基于crispr/cas13a结合非靶向循环指数扩增的检测方法，首先针对同一靶标不同基因的三种cas13a/crrna通过碱基互补配对特异性结合待测靶标核酸序列，激活cas13a反式切割活性，切割级联探针中的blocker rna，释放出的trigger dna可以激活非靶向循环指数扩增，获得的产物intrusionstrand可以将fam-bhq1-probe中的bhq1链置换下来，产生可检测的荧光信号。
4、进一步的，包括如下序列：
5、cas13a crrna-1靶向靶标sars-cov-2e基因组。cas13a crrna-2靶向靶标sars-cov-2n基因组，cas13a crrna-3靶向靶标sars-cov-2orf1ab基因组。如果更换为其他靶标，可将cas13a crrna的spacer区域重新设计。
6、blocker rna和trigger dna通过碱基互补配对组成带有一个外凸结构的杂交核酸双链，其中blocker rna带有锁核酸修饰，可以增加杂交核酸双链的tm值，增强封闭效果。
7、template序列两端与trigger dna部分序列互补，中间带有切刻内切酶nb.bbvci识别切割序列(5’-cctcagc-3’)，template与释放出的trigger dna结合后，可以启动循环指数扩增反应。
8、fam-probe和bhq1-probe通过碱基互补配对组成双链探针fam-bhq1-probe，其中fam-probe的3’端修饰fam基团。bhq1-probe的5’端修饰bhq1基团，3’端修饰spacer c3阻止其扩增。自然条件下双链探针fam-bhq1-probe呈荧光淬灭状态，当体系中产生循环指数扩增产物intrusion strand时，可以将fam-bhq1-probe中的bhq1链置换下来，产生可检测的荧光信号。
9、进一步的，包括如下序列：
10、cas13a crrna-1：5’-gagaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaacagacucacguuaacaauauugcagcagu-3’(seq id no：1)；
11、cas13a crrna-2：其核苷酸序列为5’-gagaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaacgugaugaggaacgagaagaggcuugacug-3’(seq id no：2)；
12、cas13a crrna-3：其核苷酸序列为5’-gagaccaccccaaaaaugaaggggacuaaaacacaccaucaacaaauauuuuucucacua-3’(seq id no：3)；
13、blocker rna3-lna：其核苷酸序列为5’-gggcuacauaucu/ixna_c/auaua/ixna_c/ucuauacaucggg-3’；
14、trigger dna3：其核苷酸序列为5’-cccgatgtatagaggagatatgtagccc-3’(seq idno：4)；
15、template3：其核苷酸序本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种基于CRISPR/Cas13a结合非靶向循环指数扩增的检测方法，其特征在于：首先针对同一靶标不同基因的三种Cas13a/crRNA通过碱基互补配对特异性结合待测靶标核酸序列，激活Cas13a反式切割活性，切割级联探针中的Blocker RNA，释放出的Trigger DNA可以激活非靶向循环指数扩增，获得的产物Intrusion strand可以将FAM-BHQ1-Probe中的BHQ1链置换下来，产生可检测的荧光信号。
2.根据权利要求1所述的一种基于CRISPR/Cas13a结合非靶向循环指数扩增的检测方法，其特征在于，
3.根据权利要求2所述的一种基于CRISPR/Cas13a结合非靶向循环指数扩增的检测方法，其特征在于，
4.一种基于CRISPR/Cas13a结合非靶向循环指数扩增的检测方法在检测新型人类冠状病毒上的应用。
5.如权利要求4所述应用的应用方法，其特征在于，包含有如下步骤：
6.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，
7.根据权利要求5所述的应用方法，其特征在于，
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