【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物分子分析，具体涉及一种基于固相识别和特异性富集具有o-糖基化rna的方法。
技术介绍
1、rna的n-糖基化于2021年在cell杂志首次报道，目前针对其识别方法已有相关报道，包括点击化学联合生物素可视化，半乳糖氧化酶氧化n-聚糖捕获n-糖基化rna等。最近一篇cell文章发现奎奥辛转移rna糖基化减慢了同源密码子的延伸，缺乏奎奥辛trna糖基化会增加蛋白质聚集。敲低rna糖基化酶可以缩短斑马鱼的体长。然而，现有技术手段和方法只能识别具有n-糖基化的rna，原因在于依赖n糖上面含有唾液酸的点击化学法以及rna原位杂交介导的邻位连接技术(arpla)，其它种类的n糖，特别是，rna上面是否存在o-糖基化无法进行准确判断；spcgrna仅仅识别带有半乳糖和乙酰半乳糖胺的n-糖基化。是否rna能够被o-聚糖修饰目前还未知。
技术实现思路
1、本专利技术目的是提供一种基于固相识别和特异性富集具有o-糖基化rna的方法，以解决上述问题。
2、本专利技术的一种技术方案是：
3、一种基于固相识别和特异性富集具有o-糖基化rna的方法，包括步骤：
4、(1)利用总rna提取试剂来提取总rna；
5、(2)利用半乳糖氧化酶获得氧化后o-糖基化rna；
6、(3)利用含有酰肼键的磁珠共价结合获得共价结合o-糖基化rna；
7、(4)清洗去除杂质rna；
8、(5)使用o-糖苷酶和n-乙酰半乳糖苷水解酶
9、进一步的，当所述样本为组织样本时，所述组织样本与所述trizol的比例为200mg：1ml；当所述样本为细胞样本时，所述细胞样本与所述trizol的比例为107个：1ml。
10、进一步的，所述水相与所述trizol的比例为400μl：1ml。
11、进一步的，在步骤(2)中，所述利用半乳糖氧化酶获得氧化后o-糖基化rna具体为：取总rna溶液，并依次加入二甲亚砜、半乳糖氧化酶以及辣根过氧化物，避光，反应，得到氧化后o-糖基化rna。
12、进一步的，所述总rna溶液中的总rna与二甲亚砜、半乳糖氧化酶、辣根过氧化物的比例为40-60μg：60-100μl：10-12u：10-12u。
13、进一步的，在步骤(3)中，所述利用含有酰肼键的磁珠共价结合获得共价结合o-糖基化rna具体为：向所述氧化后o-糖基化rna中加入酰肼磁珠反应，获得共价结合o-糖基化rna。
14、进一步的，在步骤(4)中，所述清洗去除杂质rna具体为：将所述共价结合o-糖基化rna转移到固相管中，利用焦碳酸二乙酯水冲洗，重复3次，收集洗脱固相的液体，即洗脱液1，对所述洗脱液1的浓度进行检测，继续洗脱直至洗脱液1检测出rna的浓度为0，再进入下一步。
15、进一步的，在步骤(5)中，所述使用o-糖苷酶和n-乙酰半乳糖苷水解酶来获得去o-糖基化rna具体为：向所述固相管中依次加入碳酸氢胺、n-乙酰半乳糖胺水解酶和o-糖苷酶，反应，离心，收集洗脱固相的液体，即洗脱液2，对所述洗脱液2的浓度进行检测，此时所述固相管中即为去o-糖基化rna。
16、进一步的，所述碳酸氢胺的用量为100μl，所述碳酸氢胺的浓度为20mm，所述n-乙酰半乳糖胺水解酶的用量为10-12u，所述o-糖苷的用量为10-12u。
17、本专利技术提供了一种基于固相识别和特异性富集具有o-糖基化rna的方法，其优点在于：
18、(1)该方法操作步骤简单，耗时短，可重复性高，应用范围广；
19、(2)该方法确定了rna上的糖基化修饰并不是只有n糖，也可存在o聚糖比如tn、t抗原；
20、(3)该方法可以成功应用于临床样本，可进行大规模的样本处理，为疾病潜在的临床标志物的寻找提供了新的方向；
21、(4)该特异性富集的方法可对同一生物样本进行o糖基化和n糖基化rna的分步依次富集，大幅度提高生物样本的利用度，特别是临床病人的生物样本。
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1.一种基于固相识别和特异性富集具有O-糖基化RNA的方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于固相识别和特异性富集具有O-糖基化RNA的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述利用总RNA提取试剂来提取总RNA具体为：将样本先用液氮研磨后加入TRIzol，裂解，静置等待分层，其中上层为水相、中间层为组织层、下层为有机层，取所述水相，并向所述水相中加入同等体积的异丙醇，静置，离心，得到白色沉淀，移除管中液体，并使用乙醇上下颠倒清洗后离心，重复3次，将清洗后的沉淀倒扣晾干，再向所述沉淀中加入焦碳酸二乙酯水获得总RNA溶液。
3.根据权利要求2所述的一种基于固相识别和特异性富集具有O-糖基化RNA的方法，其特征在于：当所述样本为组织样本时，所述组织样本与所述TRIzol的比例为200mg：1mL；当所述样本为细胞样本时，所述细胞样本与所述TRIzol的比例为107个：1mL。
4.根据权利要求2所述的一种基于固相识别和特异性富集具有O-糖基化RNA的方法，其特征在于：所述水相与所述TRIzol的比例为400μL：1mL。
<...【技术特征摘要】
1.一种基于固相识别和特异性富集具有o-糖基化rna的方法，其特征在于，包括步骤：
2.根据权利要求1所述的一种基于固相识别和特异性富集具有o-糖基化rna的方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述利用总rna提取试剂来提取总rna具体为：将样本先用液氮研磨后加入trizol，裂解，静置等待分层，其中上层为水相、中间层为组织层、下层为有机层，取所述水相，并向所述水相中加入同等体积的异丙醇，静置，离心，得到白色沉淀，移除管中液体，并使用乙醇上下颠倒清洗后离心，重复3次，将清洗后的沉淀倒扣晾干，再向所述沉淀中加入焦碳酸二乙酯水获得总rna溶液。
3.根据权利要求2所述的一种基于固相识别和特异性富集具有o-糖基化rna的方法，其特征在于：当所述样本为组织样本时，所述组织样本与所述trizol的比例为200mg：1ml；当所述样本为细胞样本时，所述细胞样本与所述trizol的比例为107个：1ml。
4.根据权利要求2所述的一种基于固相识别和特异性富集具有o-糖基化rna的方法，其特征在于：所述水相与所述trizol的比例为400μl：1ml。
5.根据权利要求1所述的一种基于固相识别和特异性富集具有o-糖基化rna的方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述利用半乳糖氧化酶获得氧化后o-糖基化rna具体为：取总rna溶液，并依次加入二甲亚砜、半乳糖氧化酶以及辣根过氧化物，避光，反应，得到氧化后o-糖基化rna。
6.根据权利要求5所述的一种基于固相识别和特异性富集具有o-糖基化rna的方法，其特征在于：所述总r...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨霜，李佳佳，温仲民，杨晓东，徐龙江，张鹏，
申请(专利权)人：核工业总医院，
类型：发明
国别省市：
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