一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途技术

本发明专利技术提供了一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途，其包括如下步骤：分别制备金银核壳纳米立方体(Au@AgNCs)溶胶和tsDNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；将所述tsDNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下孵育后，用超纯水洗涤，并用氮气吹干，得到所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针。所制备的单颗粒探针粒径在50～60nm之间，检测灵敏度达到1aM，LSPR散射光谱峰位于540～560nm。与现有技术相比，本发明专利技术具有如下的有益效果：1、与银纳米立方体相比，Au@Ag NCs具有相似的等离子体特性且结构更佳稳定；2、与一维结构的单链DNA分子以及二维结构的发夹型DNA分子相比，三维结构的tsDNA具有更好的刚性、结构稳定性以及易于多功能化等优点。

【技术实现步骤摘要】
一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途
本专利技术涉及一种基于tsDNA(四面体结构DNA)的单颗粒LSPR(局域表面等离子体共振)探针的构建方法及其用途，属于生物检测

技术介绍
MicroRNAs是一类长度在20～24个核苷酸的内源性非蛋白编码的RNAs，通常在早期发育，细胞增殖、分化、凋亡等生物学过程中起着非常重要的作用。MicroRNAs的异常表达发生在癌症前期的恶性肿瘤细胞中，与许多癌症(如：肺、肝细胞、大肠和乳腺癌等)相关。MicroRNA-21(miR-21)存在于上述许多人类的癌症组织中，尤其在肺鳞癌组织中表达水平是正常组织中的2倍之多。因此，microRNAs可以作为生物标志物用于早期癌症的诊断和预后治疗。发展一种高灵敏的分析方法跟踪检测microRNAs用于早期癌症诊断对于生物学和诊断学是至关重要的。在许多生物系统中，单分子水平的研究可以揭示分子间的相互作用、动力学以及构象的细微变化。目前用于单分子水平检测的可行方法通常需要荧光分子作标记，然而荧光探针容易发生光漂白等现象且信噪比较低。近些年来，由于其独特的依赖于尺寸、形貌、组分和微环境的光学性质，等离子体在化学和生物传感领域引起了广泛的研究兴趣。这些传感器基于贵金属纳米颗粒(如：金纳米颗粒和银纳米颗粒)的LSPR特性，通过颗粒的LSPR峰(λmax)的移动作为检测信号。LSPR传感器用于测量金属纳米颗粒表面的分子间相互作用引起了研究者们的关注。许多不同的用于固定生物分子到金属纳米颗粒表面的方法也被广泛的报道。并且，从单个金属纳米颗粒获得的信号可以提供更加详细的信息。因此，我们希望基于单个纳米颗粒水平来检测金属纳米颗粒表面的生物分子间的相互作用。然而，由于microRNAs含量低，采用基于简单的ssDNA修饰的单个金属纳米颗粒形成的探针分子构建的等离子体纳米生物传感器对miR-21的检测限只能到1fM。
技术实现思路
技术问题：本专利技术的目的是针对现有技术中的缺陷，提供一种单颗粒生物探针的构建方法及其用途，与银纳米立方体相比，Au@AgNCs具有相似的等离子体特性且结构更佳稳定；与一维结构的单链DNA分子以及二维结构的发夹型DNA分子相比，三维结构的tsDNA具有更好的刚性、结构稳定性以及易于多功能化等优点。技术方案：本专利技术的一种单颗粒生物探针的构建方法是基于tsDNA的单颗粒LSPR探针的构建方法，其包括如下步骤：分别制备Au@AgNCs溶胶和tsDNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；将所述tsDNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下进行孵育2～6h后，用超纯水进行洗涤，并用氮气吹干，得到所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针。作为优选方案，所述Au@AgNCs溶胶的制备方法包括如下步骤：合成纳米金种子；将所述纳米金种子与十六烷基三甲基氯化铵进行反应，得到金胶溶液；将所述金胶溶液与抗坏血酸在40～80℃下进行反应后，加入硝酸银，反应后得到Au@AgNCs溶胶。作为优选方案，所述Au@AgNCs在氧化铟锡导电膜玻璃表面的固定方法为：将氧化铟锡导电膜玻璃的表面清洗干净后，浸入到Au@AgNCs溶胶中，静置1～5min后取出，用超纯水清洗并用氮气吹干，即可。作为优选方案，所述tsDNA溶液的制备方法包括如下步骤：将各条单链DNA(ssDNA)溶解，在紫外分光光度计下测定260nm处的吸收，并参考每条ssDNA的摩尔消光系数，确定其浓度；将四条ssDNA以等比例混合于TM缓冲液中，加入三(2-羧乙基)膦后，转入聚合酶链式反应仪中，在90～98℃下保温10～15min后，迅速降温至0～5℃，得到tsDNA溶液。一种如前述构建方法制备的基于tsDNA的单颗粒LSPR探针在miR-21的检测以及核酸内切酶(KpnI和StuI)活性检测中的用途。作为优选方案，所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针在检测miR-21时的具体操作为：将miR-21溶液滴加到探针分子表面，在室温下反应2～5h后，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，进行LSPR散射光谱的测量。作为优选方案，所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针在检测核酸内切酶(KpnI和StuI)时的具体操作为：将2～5μL的核酸内切酶溶液与酶切缓冲液以及超纯水混合得到100～200μL的反应液。将所述反应液滴加到探针分子表面，在20～50℃反应10～30min后，用超纯水冲洗，并用氮气吹干，进行LSPR散射光谱的测量。本专利技术的基本原理在于：采用tsDNA作为支架，构建“自下而上”的单颗粒LSPR探针，在纳米尺度内控制探针之间的距离、探针取向。在此，基于tsDNA修饰的单颗粒Au@AgNC探针设计了等离子体纳米生物传感器用于单分子水平miR-21和核酸内切酶(KpnI和StuI)活性检测。对于靶分子miR-21的检测原理如图1所示，当靶分子miR-21与tsDNA分子发生杂交反应，靶分子miR-21会取代Au@AgNCs表面的水分子，由于RNA分子的折射率(RI)大于水分子的RI导致Au@AgNCs表面RI的增大，从而引起Au@AgNC-tsDNA探针分子LSPR散射峰的红移，以此作为信号实现对靶分子miR-21的检测。图2给出了基于Au@AgNC-tsDNA17-miR-21纳米复合物的核酸内切酶活性检测的示意图。从图中可以看出，当加入核酸内切酶KpnI或StuI后，tsDNA17的边会被破坏，此时tsDNA17边上DNA分子的位置就会被周围的水分子取代，导致颗粒表面RI的减小，引起探针分子的LSPR散射λmax发生蓝移，实现对核酸内切酶的检测。有益效果：与现有技术相比，本专利技术具有如下的有益效果：1、与AgNCs相比，Au@AgNCs具有相似的等离子体特性且结构更佳稳定；2、三维结构的tsDNA与一维结构的ssDNA以及二维结构的发夹型DNA相比，具有很强的刚性，可以在颗粒表面呈直立的状态；空间定位能力强，可以提高物质传质速率；并且，能够精确控制探针间的距离，提高靶分子与捕获探针的结合效率以及易于多功能化等优点。用三维结构的tsDNA代替直连DNA，并通过对tsDNA的设计，在其直立的3条边上分别对应与miR-21互补的DNA序列以及与核酸内切酶(KpnI和StuI)对应的切割位点，可以同时实现对miR-21以及核酸内切酶的检测。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本专利技术的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为本专利技术的Au@AgNC-tsDNA17探针分子识别靶分子miR-21的原理示意图；图2为本专利技术的基于Au@AgNC-tsDNA17-miR-21纳米复合物的核酸内切酶活性检测的示意图图3为本专利技术中实施例1制备得到的tsDNA的电泳分析图；图4为本专利技术中实施例2制备的Au@AgNCs的TEM图片；图5为本专利技术中实施例2制备的单个Au@AgNCs的HAADF-STEM图片以及元素扫描图片；图6为本专利技术中实施例2制备的Au@AgNCs的紫外吸收光谱图；图7为本专利技术中实施例3设计的tsDNA17的结构示意图；图8为本专利技术中实施例3得到的Au@AgNCs表面修饰tsDNA17前后的(a)暗场照片和(b)典型的LSPR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1).分别制备Au@AgNCs溶胶和四面体结构DNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；2).将所述四面体结构DNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下孵育2～6h后，用超纯水洗涤，并用氮气吹干，得到所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针。

【技术特征摘要】
1.一种单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：1).分别制备Au@AgNCs溶胶和四面体结构DNA溶液，并将所述Au@AgNCs固定于氧化铟锡导电膜玻璃表面；2).将所述四面体结构DNA溶液滴加到固定有Au@AgNCs的氧化铟锡导电膜玻璃表面，室温下孵育2～6h后，用超纯水洗涤，并用氮气吹干，得到所述基于tsDNA的单颗粒LSPR探针。2.如权利要求1所述单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，所述Au@AgNCs溶胶的制备方法包括如下步骤：1.1).合成纳米金种子；1.2).将所述纳米金种子与十六烷基三甲基氯化铵进行反应，得到金溶胶；1.3).将所述金溶胶与抗坏血酸在40～80℃下进行反应后，加入硝酸银，反应后得到Au@AgNCs溶胶。3.如权利要求1所述单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，所述Au@AgNCs固定于表面氧化铟锡导电膜玻璃的方法为：将氧化铟锡导电膜玻璃的表面清洗干净后，浸入到Au@AgNCs溶胶中，静置1～5min后取出，用超纯水清洗并用氮气吹干，即可。4.如权利要求1所述单颗粒生物探针的构建方法，其特征在于，所述四面体结构DNA溶液的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪联辉，张颖，张磊，翁丽星，周浩，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32