用于间充质干细胞（MSC）体外贴壁培养扩增的分子组合与应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合与应用。该分子组合包括：凝血酶、孕酮、转化生长因子β1、抗坏血酸和氢化考的松或氢化考的松盐，将该分子组合物加入基于IMDM的基础培养基中得到体外贴壁扩增MSC培养基。用本发明专利技术的培养基体外贴壁培养扩增MSC避免了外源添加大量粘附分子，也避免了预铺板等复杂程序，其价格低廉，作用特异性高，很好地解决了MSC的贴壁增殖问题，适用于人骨髓和人脐带来源的间充质干细胞的培养，应用前景广阔。

Molecular assembly and application of mesenchymal stem cell (MSC) culture in vitro

The invention discloses a molecular combination and application for culturing and amplifying mesenchymal stem cells (MSC) in vitro. The molecular combination includes thrombin, progesterone, TGF - beta 1, ascorbic acid and hydrogenated pine or hydrogenated pine salts. The molecular composition is added to the base medium based on IMDM to obtain an in vitro adherent amplification MSC medium. The culture medium of this invention is used to expand MSC in vitro, to avoid the addition of a large number of adhesion molecules, and to avoid complex programs such as pre padding. It has low price and high specific function. It solves the problem of MSC adhesion and proliferation. It is suitable for the cultivation of mesenchymal stem cells from human bone marrow and human umbilical cord. Broad.

【技术实现步骤摘要】
用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合与应用
本专利技术属于生物
中的细胞培养方法，特别是涉及一种用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合与其在间充质干细胞(MSC)体外培养扩增中的应用。
技术介绍
间充质干细胞，体外培养扩增后又称间充质基质细胞(mesenchymalstromalcells，MSC)，根据其来源又称骨髓基质细胞、脂肪干细胞、牙髓干细胞等。根据国际细胞治疗协会的定义，MSC是一群形态类似于成纤维细胞，表面表达干细胞标记CD90，间充质细胞标记CD73，不表达内皮细胞标记CD31，也不表达造血细胞标记CD34和CD45。此外，MSC具有成骨、成软骨和成脂肪的能力(DominiciM,LeBlancK,MuellerI,Slaper-CortenbachI,MariniF,KrauseD,DeansR,KeatingA,ProckopDj,HorwitzE.Minimalcriteriafordefiningmultipotentmesenchymalstromalcells.TheInternationalSocietyforCellularTherapypositionstatement.Cytotherapy,2006；8(4):315-7)。MSC具有体内外的免疫调节作用，也具有很强的促血管新生的功能。因此，自体或异体的MSC已经作为一种药物，被日本、新西兰、韩国和澳大利亚政府部门批准，用于治疗心肌梗塞、骨关节炎、移植物抗宿主病等疾病。细胞治疗需要一定的数量，而骨髓、脂肪、脐带等组织中的MSC含量很低，因此，需要体外培养扩增MSC才能达到治疗剂量。然而，通常人们使用胎牛血清扩增MSC，但是，胎牛血清的促细胞增殖活性具有明显的批次间差异，而且在培养过程中，MSC胞浆中可能残留牛血清中的蛋白，如牛血清白蛋白，由此可能会导致患者过敏反应，以及引起如疯牛病(BSE)、克雅病(Creutzfeldt-Jakobdisease)等疾病的风险(陈津，郭子宽，王立生，崔春萍，胡泽斌，吴朝晖，吴祖泽。大规模间充质干细胞培养技术评估报告。中国医药生物技术杂志2013；8(4)：274-84；王恒湘，郭子宽。间充质干细胞在组织再生应用中的诸多问题。组织工程与重建外科杂志2008；4(5)：241-5)。因此，使用无血清培养基培养MSC，是减少批次间差异以及临床应用安全性的可靠保证。MSC是一种贴壁生长细胞，为维持细胞增殖活性，在无血清培养基中需添加大量的粘附分子，如黏连蛋白(fibronectin)、玻连蛋白、胶原等。或者，使用上述分子预铺板，之后接种单个核细胞或传代培养的MSC，以保障MSC的贴壁。加拿大StemCell公司(STEMCELLTECHNOLOGIES,Canada)提供的人MSC无血清培养基MesenCultTM-ACFculturekit(货号为05449)就包含单独的细胞贴壁分子组合MesenCultTM-ACFAttachmentSubstrate。在无血清培养基中添加粘附分子无疑会增加培养基成本，而单独提供粘附基质，会使细胞培养过程变得复杂。此外，由于选择不同生产厂或提供商的培养瓶/皿，MSC的粘附性也会发生变化，影响MSC的生长。因此，找到一种简单的促使MSC贴壁的体外培养扩增方法，具有一定的实用价值。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合。本专利技术所提供的用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合，添加在无血清培养基中，通过刺激间充质干细胞高表达粘附分子受体(如整合素、选择素、钙粘蛋白等)及自分泌多种粘附分子(如纤粘蛋白、胶原、玻连蛋白等)，使间充质干细胞在无血清条件下，无需外源添加粘附分子也可维系原代或传代间充质干细胞的贴壁生长及增殖。所述分子组合包括：(1)凝血酶；(2)孕酮；(3)转化生长因子β1(TGF-β1)；(4)抗坏血酸；(5)氢化考的松或氢化考的松盐。在无血清培养基中所述凝血酶的可选含量为100-20000U/L(0.1-20U/mL)，推荐含量为100-1000U/L(0.1-1U/mL)，优选含量为500U-1000U/L(0.5-1U/mL)。在无血清培养基中所述孕酮的可选含量为1-100μg/L(1-100ng/mL)，推荐含量为10-50μg/L(10-50ng/mL)，优选含量为20-30μg/L(20-30ng/mL)。在无血清培养基中所述转化生长因子β1(TGF-β1)的可选含量为0.5-20μg/L(0.5-20ng/mL)，推荐含量为1-10μg/L(1-10ng/mL)，优选含量为1-3μg/L(1-3ng/mL)。在无血清培养基中所述抗坏血酸的可选含量为10-100mg/L(10-100μg/mL)，推荐含量为10-30mg/L(10-30μg/mL)，优选含量为20-25mg/L(20-25μg/mL)。在无血清培养基中所述氢化考的松或氢化考的松盐(如氢化考的松琥珀酸盐、氢化考的松丁酸盐、醋酸氢化考的松等)的可选含量为10-9M-10-6M/L(10-12M-10-9M/mL)，推荐含量为10-8-10-7M/L(10-11M-10-10M/mL)，优选含量为1-2×10-8M/L(1-2×10-11M/mL)。本专利技术的第二个目的是提供一种用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的培养基。本专利技术所提供的用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的培养基(简称MSC培养基)，是以添加了常规量人白蛋白、胰岛素、转铁蛋白、硒、乙醇胺、脂类混合物、生物素和氨基酸的IMDM培养基(无血清培养基)作为基础培养基，每升(/L)基础培养基中再添加凝血酶100-20000U，孕酮1-100μg，转化生长因子β1(TGF-β1)0.5-20μg，抗坏血酸10-100mg，氢化考的松或氢化考的松盐10-9M-10-6M。每升(/L)基础培养基含有：IMDM粉剂17.7g，NaHCO33.24g，人白蛋白0.5-5g，胰岛素-转铁蛋白-硒混合物1-10mL，乙醇胺1-10×10-5M，脂类混合物1-10mL，生物素1-20mg，丙酮酸钠55-220mg，羟乙基哌嗪乙硫磺酸1-20mM，L-谷氨酰胺146-730mg，多胺混合物1-10mL，RPMI1640氨基酸溶液1-20mL。推荐的MSC培养基，每升(/L)基础培养基中添加凝血酶100-1000U，孕酮10-50μg，转化生长因子β1(TGF-β1)1-10μg，抗坏血酸10-30mg，氢化考的松或氢化考的松盐10-8-10-7M。优选的MSC培养基，每升(/L)基础培养基添加凝血酶500-1000U，孕酮20-30μg，转化生长因子β1(TGF-β1)1-3μg，抗坏血酸20-25mg，氢化考的松或氢化考的松盐1-2×10-8M。上述用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的培养基在体外贴壁培养扩增间充质干细胞(MSC)中的应用也属于本专利技术的内容。本专利技术的第三个目的是提供一种体外贴壁培养扩增间充质干细胞(MSC)的方法。本专利技术所提供的体外贴壁培养扩增间充质干细胞(MSC)的方法，是将间充质干细本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合，包括：(1)凝血酶；(2)孕酮；(3)转化生长因子β1(TGF‑β1)；(4)抗坏血酸；(5)氢化考的松或氢化考的松盐。

【技术特征摘要】
1.用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合，包括：(1)凝血酶；(2)孕酮；(3)转化生长因子β1(TGF-β1)；(4)抗坏血酸；(5)氢化考的松或氢化考的松盐。2.根据权利要求1所述的用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合，其特征在于：加入基础培养基中，所述凝血酶的可选含量为100-20000U/L(0.1-20U/mL)，推荐含量为100-1000U/L(0.1-1U/mL)，优选含量为500U-1000U/L(0.5-1U/mL)。3.根据权利要求1或2所述的用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合，其特征在于：加入基础培养基中，所述孕酮的可选含量为1-100μg/L(1-100ng/mL)，推荐含量为10-50μg/L(10-50ng/mL)，优选含量为20-30μg/L(20-30ng/mL)。4.根据权利要求1或2或3所述的用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合，其特征在于：加入基础培养基中，所述转化生长因子β1(TGF-β1)的可选含量为0.5-20μg/L(0.5-20ng/mL)，推荐含量为1-10μg/L(1-10ng/mL)，优选含量为1-3μg/L(1-3ng/mL)。5.根据权利要求1至4任一项所述的用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合，其特征在于：加入基础培养基中，所述抗坏血酸的可选含量为10-100mg/L(10-100μg/mL)，推荐含量为10-30mg/L(10-30μg/mL)，优选含量为20-25mg/L(20-25μg/mL)。6.根据权利要求1至5任一项所述的用于间充质干细胞(MSC)体外贴壁培养扩增的分子组合，其特征在于：加入基础培养基中，所述氢化考的松或氢化考的松盐(如氢化考的松琥珀酸盐、氢化考的松丁酸盐、醋酸氢化考的松等)的可选...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭子宽，王恒湘，
申请(专利权)人：北京三有利生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11