一种基于磁微粒氢化可的松化学发光免疫分析方法及试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种全自动的基于磁微粒氢化可的松化学发光免疫分析方法及应用。首先将羊抗兔包被免疫磁珠，化学发光物标记检测抗原，应用氢化可的松的特异性抗体，构建竞争反应模式，以全自动化学发光免疫分析仪为检测工具，根据所测发光值对氢化可的松的进行定量检测。本发明专利技术所构建的方法对氢化可的松的最大检测范围达到0.42～72.27 ng/mL，检测限为0.12 ng/mL，灵敏度可达5.57 ng/mL，回收率为84.3%～102.3%。该方法检测过程可实现全自动化，不用考虑需要专业检测人员的影响，整个检测过程快仅需40分钟左右即可完成，且检测限低、灵敏度高、线性范围广，满足市场需求具有很好的市场应用前景。

A hydrocortisone chemiluminescence immunoassay method and kit based on magnetic particles

The invention discloses a fully automatic hydrocortisone chemiluminescence immunoassay method based on magnetic particles and its application. First, the Sheep anti rabbit bag was immunomagnetic beads, the chemiluminescence was labeled and the antigen was detected. The specific antibody of hydrocortisone was used to construct the competitive reaction mode. The automatic chemiluminescence immunoanalyzer was used as the testing tool, and the quantitative detection of hydrocortisone was carried out according to the measured luminescence value. The maximum detection range of hydrocortisone is 0.42 to 72.27 ng/mL, the detection limit is 0.12 ng/mL, the sensitivity is 5.57 ng/mL, and the recovery rate is 84.3% ~ 102.3%. The detection process can be fully automated, without the need of the impact of professional inspectors. The whole detection process is only about 40 minutes to complete, and the detection limit is low, the sensitivity is high, and the linear range is wide. It has a good market prospect to meet the market demand.

【技术实现步骤摘要】
一种基于磁微粒氢化可的松化学发光免疫分析方法及试剂盒
本专利技术属于食品加工
更具体地，涉及一种基于磁微粒氢化可的松化学发光免疫分析方法及试剂盒。
技术介绍
氢化可的松又称皮质醇，属于糖皮质激素，由哺乳动物脊椎肾上腺皮层产生，在生物体内可以调节糖代谢，促进蛋白质转化为糖，药理上具有抗炎消肿、抑制免疫反应、抗休克、抗毒素等作用。个别养殖户会在动物生长过程中非法使用糖皮质激素，会导致其残留在动物源食品中。并且，糖皮质激素的作用极强，人若长期食用含糖皮质激素的食品，即使含量微小也会引发糖、盐、蛋白质脂肪代谢的紊乱，胰岛素抗性和Ⅱ期糖尿症，还甚至会引发高血压、骨质疏松、肌肉萎缩等病症。各国对其在动物源食品中最大残留量做出相应规定，中国农业部2002年颁布的235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》和欧盟都规定氢化可的松仅可做外用。日本、美国则规定了其动物源食品中最大残留量不超过10μg/mL。目前针对氢化可的松的检测方法有液相色谱法、液相色谱-质谱连用技术、酶联免疫分析方法、电化学免疫分析方法等。传统色谱分析方法虽优点诸多，但由于我国动物食品生产面积广，且经营较分散，因此不能满足大量样品快速检测的需求。免疫分析方法，它被称为“21世纪最具竞争力的快速检测方法”。其中，化学发光免疫分析方法基于反应释放的光子数来指示反应物的浓度的原理，与传统的酶联免疫分析相比，发光效率高，反应速度快，不需要催化剂催化，因此具有高灵敏度，宽检测范围，良好的稳定性。传统的氢化可的松免疫分析方法主要采用酶联免疫吸附法，这种方法检测过程中处于开放空间，易产生交叉污染，且实验主要采用手工操作，使加样量不精确，容易发生操作差错近而影响实验结果的精确度与准确度。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有氢化可的松检测存在的缺陷和不足，提供一种全自动的快速稳定且检测限低，灵敏度高的检测氢化可的松的化学发光免疫分析方法。本专利技术的第一个目的是提供一种氢化可的松半抗原。本专利技术的第二个目的是提供一种氢化可的松半免疫原或检测抗原。本专利技术的第三个目的是提供一种氢化可的松特异性抗体。本专利技术的第四个目的是提供一种全自动的基于磁微粒氢化可的松化学发光免疫分析方法。本专利技术的第五个目的是提供一种基于磁微粒氢化可的松化学发光免疫分析的试剂盒。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：一种氢化可的松半抗原，所述半抗原具有式(I)所示结构式：本专利技术所述氢化可的松半抗原的制备方法将氢化可的松与戊二醛进行酰化反应使氢化可的松结构上的D环的羟甲基酰化成为含有5个碳的羧基间隔臂，即得；反应式如下所示：一种氢化可松免疫原或检测抗原，其特征在于，将上述制备得到的氢化可的松半抗原和牛血清蛋白或卵清蛋白通过活泼酯法进行偶联得到；反应式如下所示：本专利技术还请求保护上述氢化可松免疫原或检测抗原在氢化可的松化学发光免疫分析和/或在制备氢化可的松化学发光免疫分析试剂盒中的应用。一种氢化可松特异性抗体，将上述制备得到的所述氢化可松免疫原免疫兔，得到氢化可松特异性抗体。本专利技术还请求保护上述氢化可松特异性抗体在氢化可的松化学发光免疫分析和/或在制备氢化可的松化学发光免疫分析试剂盒中的应用。一种全自动的基于磁微粒氢化可的松化学发光免疫分析方法，应用全自动管式化学发光免疫分析仪，将不同浓度的氢化可的松标准品、羊抗兔抗体包被的免疫磁珠和上述制备得到的氢化可松特异性抗体在37℃条件下反应，再加入化学发光物标记的上述氢化可的松检测抗原继续反应，经仪器磁力板清洗多次后，加入预激发液和激发液，检测发光值，根据所得发光值绘制标准曲线，再将待测样品通过上述方法进行检测。优选地，所述不同浓度的氢化可的松标准品为用0.01mol/L的PBS溶液配制的溶度分别为0.1、5、10、50、100、500、4000和40000ng/mL的溶液。优选地，反应温度为37℃，反应时间为18min。优选地，所述羊抗兔抗体包被的免疫磁珠浓度为0.4μg/mL。优选地，所述氢化可松特异性抗体和化学发光物标记的氢化可的松检测抗原均为稀释5000倍。优选地，所述氢化可的松标准品、羊抗兔抗体包被的免疫磁珠、氢化可松特异性抗体和化学发光物标记的氢化可的松检测抗原的体积比为1：1：1：1(优选为50μL：50μL：50μL：50μL)。优选地，所述预激发液和激发液的体积均为100μL。优选地，所述羊抗兔抗体包被的免疫磁珠制备方法为：用N-羟基丁二酰亚胺与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺活化羧基磁珠，向已活化磁珠中加入羊抗兔偶联，经旋转过夜反应16～20h，再将得到包被羊抗兔的磁珠偶联物用TBST清洗与封闭，4℃储存备用。具体地，所述羊抗兔抗体包被的免疫磁珠制备方法为：S1.取羧基化的磁微粒悬浮液，磁分离去上清后用Bindingbuffer(0.1mol/LMES，pH5.0)缓冲溶液重悬，加入偶联剂N-羟基丁二酰亚胺和1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液反应10～30min，活化磁微粒表面羧基；S2.向已活化的磁微粒中加入羊抗兔抗体，室温下旋转混合15～20h，磁分离去上清后用TBST缓冲液重悬，得到羊抗兔抗体包被的羧基化的磁微粒。更优选地，步骤S1所述羧基磁珠：N-羟基丁二酰亚胺：1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺的摩尔浓度比为5：8。更优选地，步骤S1所述磁珠与步骤S2所述羊抗兔抗体的摩尔浓度比为40：1。优选地，所述的化学发光物标记检测抗原制备方法为：向制备得到的所述氢化可的松检测抗原中加入化学发光标记物，避光振荡反应15～20h；再将标记化学发光标记物的抗原进行洗脱，使多余的化学发光标记物与标记好的抗原分离开，收集合并标记的抗原，加入总体积1％的蛋白稳定剂，2～8℃保存。具体地，所述的化学发光物标记检测抗原制备方法为：S1.取制备得到的所述氢化可的松检测抗原于10KD超滤离心管中，加入缓冲液离心浓缩。S2.向S1中的抗原中加入化学发光标记物，避光振荡反应15～20h.S3.利用纯化柱将标记化学发光标记物的抗原进行洗脱，使多余的化学标记物与标记好的抗原分离开，收集合并标记的抗原，加入总体积1％的蛋白稳定剂，28℃保存。更优选地，步骤S1所述检测抗原：化学发光标记物为10：1。优选地，上述化学发光标记物为吖啶酯。本专利技术还提供一种基于磁微粒氢化可的松化学发光免疫分析的试剂盒，所述试剂盒包含氢化可的松标准品，羊抗兔抗体包被的免疫磁珠，上述制备得到的氢化可松特异性抗体，吖啶酯标记的上述制备得到的氢化可的松检测抗原。优选地，还包含预激发液与激发液。本专利技术还请求保护一种全自动的基于磁微粒氢化可的松化学发光免疫分析系统，所述系统包含上述试剂盒以及全自动管式化学发光免疫分析仪。优选地，所述全自动管式化学发光免疫分析仪的型号为Caris200。作为一种优选地实施方式，所述氢化可的松化学发光免疫分析系统的使用方法为：应用全自动管式化学发光免疫分析仪Caris200的1.5步法反应程序，设置加入氢化可的松标准品50μL，加入稀释相应倍数的包被羊抗兔的磁微球悬浊液(0.4μg/mL)50μL，氢化可的松特异性抗体(稀释5000倍)50μL，37℃条件下反应18min后，加入稀释相应倍数的标记吖啶酯的抗原50μL继续反本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种氢化可的松半抗原，其特征在于，所述半抗原具有式（I）所示结构式：

【技术特征摘要】
1.一种氢化可的松半抗原，其特征在于，所述半抗原具有式（I）所示结构式：。2.权利要求1所述氢化可的松半抗原的制备方法，其特征在于，将氢化可的松与戊二醛进行酰化反应使氢化可的松结构上的D环的羟甲基酰化成为含有5个碳的羧基间隔臂，即得。3.一种氢化可松免疫原或检测抗原，其特征在于，将权利要求1的氢化可的松半抗原和牛血清蛋白或卵清蛋白通过活泼酯法进行偶联得到。4.一种氢化可松特异性抗体，其特征在于，将权利要求3所述氢化可松免疫原免疫兔，得到氢化可松特异性抗体。5.一种全自动的基于磁微粒氢化可的松化学发光免疫分析方法，其特征在于，应用全自动管式化学发光免疫分析仪，将不同浓度的氢化可的松标准品、羊抗兔抗体包被的免疫磁珠和权利要求4所述氢化可松特异性抗体在37℃条件下反应，再加入化学发光物标记的权利要求3所述氢化可的松检测抗原继续反应，经仪器磁力板清洗多次后，加入预激发液和激发液，检测发光值，根据所得发光值绘制标准曲线，再将待测样品通过上述方法进行检测。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述羊抗兔抗体包被的免...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振林，傅慧君，刘毅新，袁利鹏，沈玉栋，孙远明，雷红涛，王弘，杨金易，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44