肺炎链球菌超快速核酸检测方法技术

本发明专利技术涉及一种肺炎链球菌超快速实时核酸检测方法，通过提取核酸，在特殊的缓冲液和圆盘式反应容器中用荧光标记引物在酶催化下进行扩增并实时定量检测标本中核酸模板的含量。特殊的缓冲液和圆盘式反应容器使本方法的反应时间比以往的荧光定量核酸检测方法的反应时间大大的缩短了，由原来的1小时以上缩短到现在的5‑10分钟，真正实现了肺炎链球菌感染的快速检测。具有反应时间短，操作简单，特异性高，尤其适合用于突发性急性肺炎链球菌感染的检测，有很高的推广价值。 1

【技术实现步骤摘要】
肺炎链球菌超快速核酸检测方法
本专利技术涉及一种核酸检测方法，具体涉及一种肺炎链球菌的超快速核酸实时荧光定量检测方法。可用于肺炎链球菌的核酸定量检测，尤其适合用于肺炎链球菌感染的快速检测。
技术介绍
1985年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等人专利技术了具有划时代意义的聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction，PCR)，使得人们可以在体外有目的地无限扩增特定的核酸片段。其原理类似于DNA的体内复制，只是在离心管中给DNA的体外合成提供一种合适条件。经过多年的发展，这一技术已经非常成熟，现在已是分子生物学研究和临床诊断领域中最重要和最常用的技术。PCR仪的出现则使该技术实现了自动化，使得PCR的技术应用更加广泛，例如在诊断遗传性疾患、检测临床标本中病原体的核酸、对法医标本作遗传学鉴定，以及分析激活癌基因中的突变情况等方面都得到了广泛的应用。与其同时，针对不用的应用领域，核酸检测技术也发展为很多种类型，其中依赖核酸序列的扩增和环介导等温扩增方法应用也较广泛。但是，核酸检测技术还面临着许多挑战，现有的核酸检测技术中整个扩增时间长达一个多小时、扩增过程也比较复杂，结果不容易重复，尤其是在突发性传染病的检测方面受到了限制。提高实时荧光定量核酸检测的反应速度，缩短整个检测时间，使其更方便地应用于临床检测，特别是突发性传染病的检测，为疾病的治疗和控制赢取宝贵的时间，则是核酸检测技术未来的一个重要发展方向。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种反应时间大幅度缩短、操作简单的超快速实时荧光定量核酸检测方法，可普遍用于多种类型标本中肺炎链球菌核酸的分析及临床检测。本专利技术所涉及的肺炎链球菌超快速实时荧光定量核酸检测方法，其特征在于：提取核酸，在特殊的缓冲液和圆盘式反应容器中用荧光标记引物在酶催化下进行扩增并实时定量检测标本中肺炎链球菌核酸模板的含量。该检测方法通过以下技术方案实现：(1)核酸模板提取：A、样品处理；B、核酸分离；C、核酸沉淀；D、核酸洗涤；E、核酸溶解；F、核酸浓度测定；G、核酸电泳检测。(2)加样：将模板、引物、酶、特殊缓冲液等加入到圆盘式反应容器。(3)荧光定量核酸检测：以特异性引物进行实时荧光PCR定量检测标本中核酸的含量。所述的特殊缓冲液含有1-100mg/L的甜菜碱作为扩增速度促进剂。所述的圆盘式反应容器为刻有凹槽的圆盘，圆盘直径为1-30厘米，厚度为0.1-3毫米，圆盘上的凹槽数目为1-200个，加样的容积为1-100微升，比起以往的离心管则加热面积更大，热传导效率更高。特殊的缓冲液和圆盘式反应容器使本方法的反应时间比以往的荧光定量核酸检测方法的反应时间大大的缩短了，由原来的1小时以上缩短到现在的5-10分钟，真正实现了肺炎链球菌感染的快速检测。该技术有以下优点：反应速度超快，反应时间超短，由传统的1个半小时反应时间缩短到5-10分钟，极大地提高了检测效率，赢得了宝贵的治疗时间；高度特异性，特异的引物确保反应不受其它因素的干扰，对序列高度同源的序列也可精确区分；超宽的定量线性范围和高度的检测灵敏度，从几个拷贝到几万个拷贝，定量线性范围跨越7个数量级。综上所述，本专利技术所涉及的肺炎链球菌核酸检测技术操作简单，反应时间短，特异性高，尤其适合用于突发性急性肺炎链球菌感染的检测，有很高的推广价值。附图说明图1为实施例1的核酸电泳结果；图2为实施例1的圆盘式反应容器的结构示意图。图中所示分别为：1、2-纯化DNA样品3-封盘膜4-加样孔5-圆盘位置固定孔具体实施方式下面结合附图1和附图2通过一个实例进一步描述本专利技术所涉及的肺炎链球菌超快速实时荧光定量核酸检测方法，但本专利技术所涉及的范围并不局限于本实例。实施例一人血液中肺炎链球菌的超快速定量检测1、病原体DNA提取(1)样品处理：取100μL～500μL血液标本，加1.4mLAS缓冲液，反复混匀；(2)将重悬物70℃温育5分钟；(3)涡旋振荡15秒，室温放置1分钟。最高速离心1分钟沉淀；(4)转移900μl上清到一个1.5ml离心管，加入100μl杂质清除剂，立刻涡旋振荡1分钟，室温放置1分钟。最高速离心3分钟去除杂质；(5)转移所有上清到一个1.5ml离心管，最高速离心3分钟；(6)转移210μl上清到一个1.5ml离心管，加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀，加入200μl结合液，涡旋振荡15秒，充分混匀。70℃温育10分钟；(7)冷却后加入100μl异丙醇，涡旋混匀；(8)将上一步所得溶液和可能出现的沉淀都加入一个吸附柱中，13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液；(9)加入500μl抑制物去除液，12,000rpm离心30秒，弃废液；(10)加入700μl漂洗液，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；(11)加入500μl漂洗液，12,000rpm离心30秒，弃掉废液；(12)将吸附柱放回空收集管中，13,000rpm离心2分钟；(13)取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟；(14)RNA浓度测定：吸取1μLDNA用水稀释10倍后，在微量分光光度计上测定DNA浓度，以水做空白对照，同时记录DNA浓度及其OD260/OD280，按照公式计算DNA浓度，DNA浓度＝50ng/μL×OD260×稀释倍数；(7)DNA电泳检测：A、凝胶制备：取0.8g琼脂糖加100mL0.5×TBE稀释缓冲液，煮沸，冷却至70℃左右加入适量溴化乙锭，倒胶至插有梳子的胶板上；B、电泳缓冲液配制(0.5×TBE)：取50mL5×TBE，用去离子水稀释至500mL，倒入电泳槽中；C、DNA样品处理：取DNA样品约10μL，加入2μL6×DNA上样缓冲液；D、DNA电泳：把DNA胶放入电泳槽中，80V作用电泳约5min，再在点样孔中点入处理过的DNA样品，80V左右电泳至溴酚蓝至胶的1/3处，取胶观察或拍照；(8)DNA抽提结果：DNA电泳图见附图1；(9)所得总DNA样品可立即使用或放-80℃保存；3、荧光定量超快速检测反应(1)在冰上按如下比例配制荧光定量PCR的反应液：10×荧光定量PCR缓冲液2μL，20mg/L甜菜碱1μL，5U/μLDNA聚合酶0.5μL，40×荧光定量染料0.5μL，10mMdNTPs2μL，2μM正向引物2μL，2μM反向引物2μL，DNA样品2μL，去RNA酶超纯水8μL，总体积为20μL；(2)混匀上述荧光定量PCR的反应液，加入到圆盘式反应容器中，每个加样孔加反应液20μL，所有加样孔都加完后，用封盘膜盖上，密封好，按圆盘位置固定孔的分布放置到温度循环仪上，当圆盘不停转动时，完成PCR循环，并同步完成扩增产物荧光强度的检测；(3)荧光定量PCR反应：使用标准的三步法进行检测，反应循环设定如下：95℃预变性10分钟；95℃变性10秒钟，57℃退火20秒钟，72℃延伸10秒钟；40个循环；(4)扩增分析：按照所用仪器的软件分析扩增曲线及溶解曲线，确定标本中的肺炎链球菌的量。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.肺炎链球菌超快速核酸检测方法，其特征在于：提取核酸，在特殊的缓冲液和圆盘式

【技术特征摘要】
1.肺炎链球菌超快速核酸检测方法，其特征在于：提取核酸，在特殊的缓冲液和圆盘式反应容器中用荧光标记引物在酶催化下进行扩增并实时定量检测标本中核酸模板的含量。2.如权利要求1所述的超快速核酸检测方法，其特征在于：所述特殊的缓冲液含有1-100mg/L的甜菜碱作为扩增速度促进剂。3.如权利要求1所述的超快速核酸检测方法，其特征在于：...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯长访，
申请(专利权)人：美科生物医学技术无锡有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32