酶复合物及自组装催化纳米线制造技术

本发明专利技术提供成纤维蛋白在增强酶催化活性和/或酶稳定性中的应用。本发明专利技术通过纤维样蛋白结构的自组装，将酶分子高密度、阵列化地展示在成纤维蛋白纳米结构的表面，形成具有催化能力的线状纳米结构。该纳米结构模拟了细胞内酶分子的天然区域化状态，从而在不对酶分子本身进行改变的情况下，提高酶的催化活性和稳定性。例如，纳米线状态的Sup35‑MPH的米氏常数Km不足游离MPH的1/5，催化常数Kcat提高了1倍，最大速率Vmax提高了26.5倍，比活力提高了4.8倍；相较于游离酶ATA‑117，在相同反应时间内，纳米线状态的Sup35‑ATA‑117的底物转化率可提高30％左右，达到最高转化率的时间缩短4倍多。

Enzyme complex and self assembled catalytic nanowire

The invention provides the application of fibrin in enhancing enzyme catalytic activity and / or enzyme stability. By self-assembly of fibrin structure, the invention displays the enzyme molecules on the surface of the fibroin nanostructure with high density and array, and forms a linear nanostructure with catalytic ability. The nanoscale structure simulates the natural regionalization of the intracellular enzyme molecules, thus improving the catalytic activity and stability of the enzyme without changing the enzyme molecule itself. For example, the Michaelis constant Km of the nanowire state of Sup35 MPH is less than the 1/5 of free MPH, the catalytic constant Kcat increases 1 times, the maximum rate Vmax increases 26.5 times and the activity is 4.8 times higher; compared with the free enzyme ATA 117, the substrate conversion rate of the Sup35 ATA ATA 117 of the nanowire state can be increased by 30% in the same reaction time. The time to achieve maximum conversion is shortened by 4 times.

【技术实现步骤摘要】
酶复合物及自组装催化纳米线
本专利技术涉及酶催化剂，特别涉及一种酶复合物及自组装催化纳米线。
技术介绍
酶作为一种生物催化剂，已广泛应用于生产、生活的各个领域。近几十年来，随着酶工程不断的技术性突破，在工业、农业、医药卫生、能源开发及环境工程等方面的应用越来越广泛。在对酶催化过程的研究和应用过程中，人们总是期望酶的活力和稳定性越高越好，并具备良好的催化性能。如何提升酶蛋白的催化能力是学术界的研究热点之一，同时也是工业生产实践中迫切需要解决的问题。传统的各种提升酶蛋白催化能力的方法主要包括化学修饰、分子酶工程等。酶化学修饰是应用化学方法主要包括1)在酶蛋白特殊位点引入特定分子进行修饰的定点突变方法；2)使用双功能基团试剂如戊二醛、PEG等将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内不同肽链部分，进行共价交联的交联技术；3)利用小分子化合物对酶活性部位或活性部位之外的侧链基团进行化学修饰的小分子化合物修饰等方法对酶分子施行种种化学修饰，通过主链的切割、剪接和侧链基团的化学修饰对酶蛋白进行分子改造，以改变其理化性质及生物活性。酶化学修饰主要是通过化学基团的引入或除去，且修饰大都发生在酶活性部位或必需基团上，这样不仅使酶蛋白共价结构发生改变，而且使得酶蛋白活性随着修饰程度的加深而逐渐减弱，即酶化学修饰并不能有效的提高酶自身的催化效率，反而会降低酶活。分子酶工程是采用基因工程和蛋白质工程的方法和技术，研究酶基因的克隆和表达、酶蛋白的结构与功能的关系，并以其为基础对酶分子进行再设计和定向加工。分子酶工程需要从一个或多个已经存在的亲本酶出发，经过基因的突变和重组，构建一个人工突变酶库，通过一定的筛选或选择方法最终获得具有某些特性的进化酶。分子酶工程方法不仅依赖于亲本酶分子的结构生物学数据的完善，还需要费时费力得构建人工突变酶库，后期的筛选过程更是复杂繁琐。综合酶化学修饰和分子酶工程技术来看，二者的工作都集中于加工单个酶分子，并没有考虑到酶分子在活细胞内的整体分布情况。越来越多的研究表明酶分子在细菌体内并不是像在溶液里一样均匀分散的，而是成簇存在的，这种以超分子聚集体形态出现酶分子簇具有更高的催化活性。但是通过基因克隆所表达出来的酶分子往往以单分散的形式出现，这可能是所制备的酶分子与天然状态酶分子相比活性降低的原因之一。
技术实现思路
本专利技术为克服现有技术中存在的酶的催化特性和稳定性提高有限、制备复杂、成本高且针对特定的酶需要寻找适合于该酶的试剂、材料或方法等缺点，提供了成纤维蛋白在增强酶催化活性和/或酶稳定性中的应用。本专利技术所述的成纤维蛋白为amyloidogenesisfibrils(淀粉样成纤维蛋白)，简称成纤维蛋白。为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案：本专利技术一方面提供成纤维蛋白在增强酶催化活性和/或酶稳定性中的应用。示例性地，所述成纤维蛋白与所述酶形成酶复合物，所述酶直接或间接连接于所述成纤维蛋白。示例性地，所述酶通过连接肽和/或接头蛋白连接于所述成纤维蛋白。在本专利技术一具体实施方式中，所述酶通过连接肽连接于所述成纤维蛋白。在本专利技术一具体实施方式中，所述成纤维蛋白形成纤维状纳米结构。在本专利技术一具体实施方式中，所述成纤维蛋白与所述酶形成的酶复合物自组装形成纤维状纳米结构。在本专利技术一具体实施方式中，所述纤维状纳米结构由成纤维蛋白自组装形成。示例性地，所述成纤维蛋白可为任何能够形成纤维状，并能够与酶相连接的蛋白。示例性地，所述成纤维蛋白为酵母朊蛋白或淀粉样蛋白。例如可为酵母朊蛋白Sup35、淀粉样蛋白Ure2、丝素蛋白等。示例性地，所述成纤维蛋白为酵母朊蛋白Sup35，优选地，成纤维蛋白为酵母朊蛋白Sup35的第1-61位氨基酸形成的自组装结构域。在本专利技术一具体实施方式中，所述酶选自蛋白酶、核酸酶或人工酶。在本专利技术一具体实施方式中，所述酶选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或合成酶。示例性地，氧化还原酶如葡萄糖氧化酶、过氧化氢酶、氢化酶、加氧酶等。示例性地，转移酶如转甲基酶、转氨酶、己糖激酶、磷酸化酶等。具体地，如西塔列汀转氨酶。示例性地，水解酶如酯酶、糖基酶、肽酶、核酸酶等。具体地，如甲基对硫磷水解酶。示例性地，裂合酶如醛缩酶、水化酶、脱氨酶、碳酸酐酶、丙酮酸脱羧酶、碱性磷酸酶等。示例性地，异构酶如消旋酶、差向异构酶、变位酶等。示例性地，合成酶如氨酰tRNA合成酶、谷氨酰胺合成酶、海藻糖合成酶等。在本专利技术一具体实施方式中，所述酶包括以碳水化合物、蛋白质、脂肪、核酸、生物碱为底物的酶。示例性地，以碳水化合物为底物的酶如淀粉酶，葡萄糖异构酶，乳糖酶，凝乳酶，纤维素酶，聚糖酶，乳糖酶等；以蛋白质为底物的酶如菠萝蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等；以脂肪为底物的酶如脂肪酶、酯酶等；以核酸、生物碱为底物的酶如碱性磷酸酶等。本专利技术另一方面提供上述酶复合物的制备方法，其包括通过分子克隆，将成纤维蛋白与酶分子融合或者将成纤维蛋白、连接肽(或街头蛋白)、酶分子融合形成融合蛋白基因，并将该融合蛋白基因进行表达。在本专利技术一具体实施方式中，上述酶复合物的制备方法由以下步骤组成：通过分子克隆，将成纤维蛋白、连接肽、酶分子融合形成融合蛋白基因，并将该融合蛋白基因进行表达、纯化。在本专利技术一具体实施方式中，所述成纤维蛋白为酵母朊蛋白自组装结构域Sup35，所述酶为甲基对硫磷水解酶MPH(或西塔列汀转氨酶ATA-117)。酶复合物具体的制备方法包括：通过分子克隆将酵母朊蛋白自组装结构域Sup35和甲基对硫磷水解酶MPH的基因mph(或西塔列汀转氨酶ATA-117的基因ata-117)通过连接肽(例如：GGGGS)融合连接形成融合蛋白基因Sup35-mph(或Sup35-ata-117)；将融合蛋白基因Sup35-mph(或Sup35-ata-117)克隆入表达载体中，将表达载体转入表达宿主中培养，诱导表达融合蛋白Sup35-MPH(或Sup35-ATA-117)并纯化。在具体实施方式中，融合蛋白基因的表达、纯化可采用本领域常规用于蛋白表达纯化的方法，例如将融合蛋白基因克隆入表达载体，将表达载体转入表达宿主中培养，活化至对数生长期后加入诱导表白蛋白，经破碎、纯化后得到融合蛋白。其中，本专利技术对表达载体、表达宿主的种类和类别不作限定，可选用本领域常规用于遗传修饰的载体和宿主。具体的，表达载体可为pET-28、pET-32、pET-15或pET-11等；表达宿主可选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、酿酒酵母、毕赤酵母或哺乳动物细胞。在具体实施方式中，接头蛋白可代替连接肽，同样可以减少融合蛋白可能存在的位阻的影响。本专利技术又一方面提供一种自组装催化纳米线，其包括本专利技术中的酶复合物或上述制备方法制得的酶复合物，其中，所述酶复合物中50％以上的成纤维蛋白直接或间接连接有酶。示例性地，55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％的成纤维蛋白直接或间接连接有酶，具体比例可依据实际生产需要及成本而确定。示例性地，成纤维蛋白通过连接肽和/或接头蛋白连接于酶。示例性地，所述连接肽为GGGGS。在本专利技术一具体实施方式中，成纤维蛋白自组装形成纤维纳米结构。本专利技术还一方面提供自组装催化纳米线的制备方法，本文档来自技高网...

【技术保护点】
成纤维蛋白在增强酶催化活性和/或酶稳定性中的应用。

【技术特征摘要】
1.成纤维蛋白在增强酶催化活性和/或酶稳定性中的应用。2.如权利要求1所述的应用，所述成纤维蛋白与所述酶形成酶复合物，所述酶直接或间接连接于所述成纤维蛋白，优选地，所述酶通过连接肽和/或街头蛋白连接于所述成纤维蛋白。3.如权利要求1或2所述的应用，所述成纤维蛋白，或所述成纤维蛋白与所述酶形成的酶复合物自组装形成纤维状纳米结构，所述成纤维蛋白为酵母朊蛋白或淀粉样蛋白，优选地，所述成纤维蛋白为酵母朊蛋白Sup35；以及任选地，所述酶选自氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或合成酶。4.如权利要求3所述的应用，所述酶选自葡萄糖氧化酶、淀粉酶、胃蛋白酶、碱性磷酸酶、纤维素酶、聚糖酶、乳糖酶、脂肪酶、酯酶、甲基对硫磷水解酶或西塔列汀转氨酶，优选地，所述酶为甲基对硫磷水解酶或西塔列汀转氨酶。5.一种如权利要求2-4中任一项所述的应用中，所述酶复合物的制备方法包括或者由以下步骤组成：通过分子克隆，将成纤维蛋白与酶分子融合或者将成纤维蛋白、连接肽(或街头蛋白)、酶分子融合形成融合蛋白基因，并将该融合蛋白基因进行表达。6.自组装催化纳米线，包括权利要求2-4中任一项所述的酶复合物或权利要求5所制备的酶复合物，其中，所述酶复合物中50％以上的成纤维蛋白直接或间接连接有酶，优选地，60％或70％或80％或90％或95％以上的成纤维蛋白直接或间接连...

【专利技术属性】
技术研发人员：门冬，张先恩，魏翠华，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42