蝎活性多肽ADP-7及其应用制造技术

本发明专利技术公开了蝎活性多肽ADP‑7及其应用，属于生物技术领域。本发明专利技术设计的蝎活性多肽具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列。该多肽作为钾离子通道Kv1.3阻断剂具有高选择性和低毒性。本发明专利技术提供了所述蝎活性多肽在治疗或预防钾通道Kv1.3相关疾病药物中的应用。

The active polypeptide ADP-7 of scorpion and its application

The present invention discloses scorpion active polypeptide ADP 7 and its application, belonging to the field of biotechnology. The scorpion active polypeptide designed by the invention has an amino acid sequence shown in SEQ ID NO:1. As a potassium channel Kv1.3 blocker, the polypeptide has high selectivity and low toxicity. The invention provides the application of the scorpion active polypeptide in the treatment or prevention of potassium channel Kv1.3 related diseases.

【技术实现步骤摘要】
蝎活性多肽ADP-7及其应用
本专利技术涉及生物
，尤其涉及蝎活性多肽ADP-7及其应用。
技术介绍
自身免疫性疾病(autoimmunedisease)是机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，即人体免疫系统攻击自身的组织。全球约有5～8％的人口受到约40多种自身免疫性疾病的威胁，包括T细胞介导的类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、白塞病、自身免疫性甲状腺病和I型糖尿病等。在类风湿性关节炎中免疫系统攻击病患的关节部位，多发性硬化症是神经细胞的神精髓鞘(myelinsheaths)受到攻击。这些疾病涉及全身一种或多种组织和器官，严重影响人体健康及生命。针对自身免疫性疾病，目前无有效疗法，且病情反复发作。目前常用对抗自体免疫性疾病的方法，一是利用类固醇来减缓因免疫系统攻击组织所造成的炎症反应，二是使用免疫抑制药物，抑制免疫系统的作用，但这两种方法都会造成严重的副作用，而且都只能减缓病情的发展速度，不能根治疾病。为了改变自身免疫性疾病药物治疗的落后现状，急需探索新的疾病预防和治疗方法。自身免疫性疾病通常由T细胞和B细胞介导。T细胞和B细胞的细胞膜上钾离子通道Kv1.3已成为预防和治疗疾病的新药靶标。从我们团队最新发表的钾离子通道Kv1.3相关多肽新药研究综述可见(BingzhengShen,ZhijianCao,WenxinLi,Jean-MarcSabatier&YingliangWu.Treatingautoimmunedisorderswithvenomderivedpeptides,ExpertOpiniononBiologicalTherapy,17(9)：1065-1075)，候选有机小分子药物几乎均作用钾通道Kv1.3和其它相似钾通道，因而极可能造成作用较强的毒副反应，导致目前它们无法进入临床试验。从有毒动物多肽资源中发现候选多肽已为新药研发的主要趋势。中国传统医药常用“以毒攻毒”的策略治疗人类的疑难杂症。蝎为常见的有毒动物，在中药材中也通常被称为“全蝎”，是治疗类风湿性关节炎的最常见的动物药材之一。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供一种靶向钾离子通道Kv1.3的蝎活性肽ADP-7及其应用，本专利技术所述蝎活性多肽ADP-7特异性作用于钾离子通道Kv1.3。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供一种蝎活性肽ADP-7，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术通过筛选我国蝎活性多肽基因库，得到了许多具有重要药用前景的多肽基因，通过我们研究团队已建立的计算机辅助筛选与设计技术[BiophysicalJournal,2004,87:105；Proteins,2008,70:744；JournalofProteomeResearch,2010,9:3118]，虚拟筛选到1个高活性作用钾离子通道Kv1.3的蝎活性肽新基因，并委托强耀生物科技有限公司(中国苏州)进行蝎活性多肽ADP-7的多肽合成。本专利技术还提供了具有通过在SEQIDNO:1所示的氨基酸序列中取代、缺失或添加一个或多个氨基酸残基所得到的氨基酸序列的多肽。本专利技术提供蝎活性肽ADP-7作为钾离子通道Kv1.3阻断剂的应用。通过膜片钳技术鉴定了所述蝎活性多肽ADP-7对钾通道Kv1.3的药理学活性。结果显示，所述蝎活性多肽ADP-7可特异性抑制钾通道Kv1.3电流，抑制电流半数的多肽浓度(IC50值)为23.4±5.0nM，表明蝎活性多肽ADP-7可特异性作用自身免疫疾病的靶标钾通道Kv1.3。本专利技术还提供了上述蝎活性肽ADP-7在制备治疗或预防钾通道Kv1.3相关疾病药物中的应用。本专利技术提供的蝎活性肽ADP-7治疗或预防钾通道Kv1.3相关疾病包括自身免疫性疾病。本专利技术提供的蝎活性肽ADP-7治疗或预防自身免疫性疾病包括多发性硬化症或类风湿性关节炎。作为优选，用于治疗或预防钾通道Kv1.3相关疾病的药物包括本专利技术提供的蝎活性肽ADP-7及药学上可接受的辅料。优选的，本专利技术提供的药物为口服制剂或注射制剂。更优选的，口服制剂为片剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、汤剂、膏剂、露剂、口服液剂、滴丸剂、糖浆剂、酊剂、散剂或冲剂。本专利技术通过在大鼠动物水平上模拟治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎检测蝎活性多肽ADP-7药物治疗效果。结果显示，蝎活性多肽ADP-7治疗后，大鼠多发性硬化症和类风湿性关节炎的症状得到显著改善，表明蝎活性多肽ADP-7能有效地治疗多发性硬化症和类风湿性关节炎。通过对蝎活性多肽ADP-7的毒性作用研究，发现蝎活性多肽ADP-7在超过自身免疫疾病动物模型治疗剂量50倍的剂量下对小鼠无明显毒性，表明蝎活性多肽ADP-7毒副作用小。本专利技术所述蝎活性多肽ADP-7分子内具有3对二硫键，在体外稳定性好，易于长期保存。膜片钳技术鉴定显示可特异性作用钾通道Kv1.3，特异性强，是目前国际上已发现的活性强的多肽。动物实验表明，重组多肽ADP-7可以有效治疗大鼠的多发性硬化症和类风湿性关节炎，药物效果显著，并且对实验动物毒副作用小。本专利技术所述蝎活性多肽的制备方法简单易行，操作方便，易于生产和制备高纯度的ADP-7蝎活性多肽。附图说明图1示蝎活性多肽ADP-7的多肽合成及质谱分子量鉴定图。图2示1μM蝎活性多肽ADP-7对钾离子通道Kv1.3电流及药物毒副反应靶标钾离子通道hERG电流的抑制示意图；图3示蝎活性多肽ADP-7钾离子通道Kv1.3电流抑制的浓度依赖试验图。具体实施方式通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。【实施例1】蝎活性多肽ADP-7的纯化和鉴定将蝎活性多肽ADP-7提交到强耀生物科技有限公司(中国苏州)进行线性多肽合成。在此基础上对多肽分子内3对二硫键进行环化，形成具有三级结构的多肽，具体的方法为：将多肽以终浓度为0.1mM溶解在0.1MTris-HCl(pH＝8.0)(华美生物工程公司)中，23℃孵育48h后经RP-HPLC进行分离，将包含有环化好的目的多肽洗脱峰进行收集(图1)。如图1所示还原型的蝎活性多肽ADP-7的洗脱时间分别为19.5min，而氧化型的蝎活性多肽ADP-7洗脱时间要晚大约3min。对二硫键进行环化多肽ADP-7通过质谱进行分子量鉴定。如图1所示氧化型的蝎活性多肽ADP-7的分子量分别为4288.2Da，它与蝎活性多肽ADP-7分子量的理论值4288.2Da完全吻合，这表明还原型的蝎活性多肽ADP-7分子内的3对二硫键在体外通过此种方法成功地发生了配对。然后将收集到的多肽按常规的方法进行冻干和定量。【实施例2】蝎活性多肽ADP-7对钾通道Kv1.3的药理学活性分析将HEK-293T细胞在含10％的胎牛血清的DMEM培养基37℃、5％CO2条件下培养，将钾通道Kv1.3和hERG重组质粒分别用SofastTM的转染试剂盒转染，转染细胞在0.8mg/mLGeneticin培养基上选择性培养。利用全细胞膜片钳用仪器(EPC-10双通道膜片钳放大器HEKA，Elektronik,Lambrecht，Germany)，对重组蝎活性多肽ADP-7的药理学活性进行测定和分析本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蝎活性肽ADP‑7，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种蝎活性肽ADP-7，其氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.如权利要求1所述的蝎活性肽ADP-7作为钾离子通道Kv1.3阻断剂的应用。3.如权利要求1所述的蝎活性肽ADP-7在制备治疗或预防钾通道Kv1.3相关疾病药物中的应用。4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述钾通道Kv1.3相关疾病包括自身免疫性疾病。5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴英亮，曹志贱，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42