本发明专利技术公开了一种稳定性提高的NADH氧化酶及其在乙偶姻生产中的应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术的突变体是在SEQ ID N0.2所示的氨基酸的基础上，将第65位丙氨酸突变成半胱氨酸。本发明专利技术得到的突变体酶60度的半衰期(t1/2)较突变期提高了1.9倍。本发明专利技术表明65位氨基酸残基突变成半胱氨酸与天然NADH氧化酶的125位半胱氨酸残基形成正确的二硫键从而提高了酶的稳定性，加强了该酶的工业应用潜力。
A stable NADH oxidase and its application in the production of acetoin
The invention discloses a NADH oxidase with improved stability and its application in the production of acetoin, belonging to the field of gene engineering technology. The mutant of the present invention is based on the amino acid shown in the SEQ ID N0.2 N0.2, and the sixty-fifth alanine is turned into cysteine. The half life (t1/2) of the mutant enzyme 60 degree raised by the invention is 1.9 times higher than that of the mutant stage. The invention showed that 65 amino acid residues were transformed into cysteine and 125 - bit cysteine residues of natural NADH oxidase to form the correct two sulfur bonds, thus improving the stability of the enzyme and strengthening the industrial application potential of the enzyme.
【技术实现步骤摘要】
一种稳定性提高的NADH氧化酶及其在乙偶姻生产中的应用
通过提高枯草芽孢杆菌NADH氧化酶稳定性减少NADH依赖型副产物提高乙偶姻产量，本专利技术属于基因工程和发酵工程领域。具体涉及一种NADH氧化酶的突变及其发酵生产。技术背景乙偶姻天然存在于玉米、葡萄、可可、苹果、香蕉、干酪、肉类等许多食品中。是一种应用广泛、令人喜爱的食用香料，具有强烈的奶油、脂肪、白脱样香气，高度稀释后有令人愉快的奶香气，因此乙偶姻主要用于配置奶香型、肉香型、草莓香型的香精，或直接用于奶制品。我国国家标准GB2760-86明确规定其为允许使用的食品级香料，美国食品和萃取协会(FEMA)安全号为2008。目前，传统的发酵技术已经成为我国现阶段食用香料行业的研究热点。利用微生物发酵生产香料的基本原理是：通过微生物的自身代谢和微生物生长过程中产生的酶进行的催化作用，经过一系列复杂的生物化学反应，使各种有机物转化为多种具有芳香气味的化合物。目前国内外研究表明某些细菌具有生产乙偶姻的能力，主要包括克雷伯氏菌属(Klebisella)、肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷氏菌属(Serratia)以及乳球菌属(Lactococcus)等。但是在大多数菌株代谢过程中，乙偶姻是作为2，3-丁二醇和丁二酮代谢的副产物而存在的，积累浓度较低，从而直接导致了难以利用这些微生物菌种工业化发酵生产乙偶姻。深入的研究。本实验室保藏有一株以葡萄糖为底物高产乙偶姻的枯草芽孢杆菌B.subtilisJNA(保藏号CCTCCM209309)，在研究中发现其发酵过程会形成部分NADH依赖型副产物，如乳酸、乙醇及2,3-丁二醇，导致乙偶姻产量无法进一步提高，因此考虑通过降低胞内NADH水平来减少这些副产物的生成。NADH氧化酶(NOX，EC1.6.99.3)可以催化NADH形成NAD+，因此该酶被广泛的应用到NADH依赖型代谢途径流量的重排上面。本专利技术提高了来自于自枯草芽孢杆菌NADH氧化酶的稳定性，并通过本实验室构建的枯草芽孢杆菌适度表达载体pMA5-PbdhA(授权号ZL201210360503.0)，将突变后的NADH氧化酶在枯草芽孢杆菌中进行表达，达到缩短发酵周期，减少NADH依赖型副产物的目的，最终实现适度表达NOX的工程菌株高效生产乙偶姻。
技术实现思路
未解决上述问题，本专利技术提供了一种稳定性提高的NADH氧化酶及其在乙偶姻生产中的应用方法等。本专利技术的第一个目的是提供一种稳定性提高的NADH氧化酶突变体，其氨基酸序列是SEQIDNO.1所示的序列。所述突变体的氨基酸序列是在氨基酸序列如SEQIDNO.2所示的氨基酸的基础上，将65位氨基酸由丙氨酸突变成半胱氨酸得到的。本专利技术的第二个目的是提供编码所述突变体的核苷酸序列。在本专利技术的一种实施方式中，编码所述突变体的核苷酸序列是SEQIDNO.3所示的序列。在本专利技术的一种实施方式中，所述核苷酸序列是在SEQIDNO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第65位的丙氨酸的密码子突变成编码半胱氨酸的密码子而得到的。本专利技术的第三个目的是提供含有编码所述突变体的核苷酸序列的重组表达载体。本专利技术的第四个目的是提供一种表达所述NADH氧化酶突变体的基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是将SEQIDNO.3所示的核苷酸序列连接到表达载体得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主菌，即得到基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌为重组枯草芽孢杆菌基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述表达载体是pMA5-PbdhA。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主菌为B.subtilisJNA。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌的制备方法，是在SEQIDNO.4所示核苷酸序列的基础上，将编码第65位的丙氨酸的密码子突变成了编码半胱氨酸的密码子，得到重组基因，将重组基因连接到表达载体得到重组质粒，重组质粒转化到B.subtilisJNA宿主菌中即得到重组基因工程菌。在本专利技术的一种实施方式中，所述的制备方法，具体是：(1)以SEQIDNO.4所示核苷酸序列为模板，Flprimer(序列如SEQIDNO.5所示)，Rlprimer(序列如SEQIDNO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQIDNO.3所示的重组基因yodc2。(2)将上一步得到的重组基因序列，连接到pMA5-PbdhA表达载体中，得到重组质粒pMA5-PbdhA-yodC2，重组质粒化转化B.subtilisJNA，获得重组工程菌株，命名为B.subtilisJNA/pMA5-PbdhA-yodC2。本专利技术的第五个目的是提供所述突变体、编码所述突变体的核苷酸序列、含有编码所述突变体的核苷酸序列的载体、表达所述突变体的基因工程菌的应用。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用，包括重组基因工程菌发酵生产乙偶姻。在本专利技术的一种实施方式中，所述应用，可用于降低微生物胞内NADH含量以及NADH依赖型副产物的合成。本专利技术的有益效果：(1)本专利技术在天然NADH氧化酶的基础上，通过定点突变改造NADH氧化酶分子结构，本专利技术的突变体酶在60℃的半衰期(t1/2)较突变期提高了1.9倍。本专利技术表明第10位氨基酸残基突变成半胱氨酸可以与天然NADH氧化酶原有的第125位半胱氨酸残基形成正确的二硫键，并伴随着稳定性的增加。(2)本专利技术通过在枯草芽孢杆菌中适度表达NADH氧化酶突变体，实现高效生产乙偶姻的方法，最终适度表达NADH氧化酶突变体的工程菌株将150g/L葡萄糖转化约为63g/L的乙偶姻和1.2g/L的2,3-丁二醇，2,3-丁二醇、乳酸和乙酸分别减少93.0％、70.0％和73.0％，较原始菌株B.subtilisJNA发酵周期缩短1.7倍。具体实施方式发酵培养基：牛肉浸膏5g/L，玉米浆6g/L，尿素2g/L，葡萄糖150g/L。调节pH6.5。酶活力定义：酶活力单位(IU)定义为在25℃条件下，每分钟氧化1μmol的NADH所需的酶量为一个酶活单位U。酶比活力定义为单位蛋白的酶活U/mg。NADH氧化酶活力测定方法：酶反应体系为1mL，含有50mmol/L磷酸钾(pH7.0)，0.3mmol/LEDTA，50μmol/LFAD和0.3mmol/Lβ-NADH；酶促反应在加入一定量的酶液后立即开始，根据反应液在340nm吸光值变化，计算出NADH的浓度，并计算出酶活力。实施例1含NADH氧化酶突变体的枯草芽孢杆菌适度表达载体的构建(1)NADH氧化酶突变体的获得：以SEQIDNO.3所示核苷酸序列为模板，Fprimer(序列如SEQIDNO.5所示)和Rprimer(序列如SEQIDNO.6所示)为引物，进行PCR即得到SEQIDNO.3所示的重组基因。(2)将重组基因与枯草芽孢杆菌适度表达载体pMA5-PbdhA分别用KpnI、HindIII双酶切，纯化后用T4DNA连接酶16℃过夜连接。连接产物化学法转化B.subtilisJNA感受态细胞。转化液涂布含卡那霉素(50mg/L)LB平板，提取质粒，双酶切验证构建的重组质粒，命名为pMA5-PbdhA-yodC2。测序工作由上海生工完成。实施例2产NADH氧化酶突变体本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种NADH氧化酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种NADH氧化酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.编码权利要求1所述突变体的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列是SEQIDNO.3所示。4.一种含有权利要求2或3所述核苷酸序列的重组表达载体。一种表达权利要求1所述NADH氧化酶突变体的基因工程菌。5.一种表达所述NADH氧化酶突变体的基因工程菌。6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是将SEQIDNO.3所示的核苷酸序列连接到表达载体得到重组质粒，然后将重组质粒转化到宿主...
【专利技术属性】
技术研发人员：张显，饶志明，杨套伟，徐美娟，韩如梦，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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