一种漆酶的修饰方法技术

本发明专利技术属于生物漆酶修饰改性技术领域，涉及一种同时提高漆酶(laccase)催化活性和稳定性的修饰方法，利用聚丙烯酸(PAA)能同时固定铜离子和酶，聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(PEGA)能提高漆酶的稳定性的原理，通过RAFT(可逆加成断裂链转移)聚合合成嵌段共聚物PAA/PPEGA,然后将制备的共聚物PAA/PPEGA与铜离子结合来提高漆酶活性，实现修饰后漆酶的催化活性和稳定性的显著提高，该方法操作步骤简单，所需化学药品加入量少，所需反应条件温和，制备效率高，制备的漆酶固定到大面积的石墨烯纸上后，能够实现漆酶在降解邻苯二酚污染物中的重复利用。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于生物漆酶修饰改性
，涉及一种同时提高漆酶(laccase)催化活性和稳定性的修饰方法，利用聚丙烯酸(PAA)能同时固定铜离子和漆酶，聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)(PPEGA)能提高漆酶的稳定性的原理，通过可逆加成断裂链转移(RAFT)聚合合成聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯)嵌段共聚物(PAA/PPEGA),并结合铜离子来提高漆酶活性，实现修饰后的漆酶催化活性和稳定性的显著提高。
技术介绍
：目前，漆酶是一类多铜氧化还原酶，广泛存在于植物、真菌和细菌中，在生物降解、化学合成、红酒保存和生物传感器等方面有着非常广泛的应用，但是由于它的稳定性差，漆酶的应用受到很大的限制，因此提高漆酶稳定性是漆酶研究中面临的一个问题。现有技术中提高漆酶稳定性的方法有固定法、胶囊法、水凝胶络合法、聚合物修饰法，然而经过上述方法修饰以后，酶的活性都出现了明显的下降。因此提高漆酶稳定性的同时，若能提高漆酶的活性将对漆酶的应用有着非常重要的意义，目前用于提高漆酶活性的方法有多种，如向漆酶溶液中加入铜离子、光催化剂或者微生物等，其中将铜离子加入到漆酶溶液中是一个非常有效并且常用的方法，但是由于铜离子是一种重金属离子，铜离子的引入会给整个酶反应体系带来二次污染。因此寻求设计一种同时提高漆酶催化活性和稳定性的方法，该方法在利用铜离子提高酶活性的同时，设法将铜离子固定，并能够同时显著提高漆酶的催化活性，该方法制备工艺过程简单，效率高，制备的产品质量好，工作环境友好，极具市场前景。
技术实现思路
：本专利技术的目的在于克服现有技术存在的缺点，设计提供一种能同时提高漆酶催化活性和稳定性的方法，该方法操作步骤简单，所需化学药品加入量少，所需反应条件温和，制备效率高，制备的漆酶固定到大面积的石墨烯纸上后，能够实现漆酶在降解邻苯二酚污染物中的重复利用。为了实现上述目的，本专利技术涉及的高活性、高稳定性的漆酶的制备具体工艺包括以下步骤：一、通过RAFT聚合合成嵌段共聚物PAA/PPEGA(聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯):(1)、将20-60mgRAFT试剂(比如芘功能化的4-氰基-4-乙基三硫代戊酸)、2-10mg偶氮二异丁腈(AIBN)、0.2-0.5g丙烯酸(PAA)，在圆底烧瓶中用2-5mL超纯水和3-7mL二氧六环溶解，将圆底烧瓶用橡胶塞密封，通入氮气30-60分钟以除去圆底烧瓶中的氧气，再将圆底烧瓶油浴在20-90℃下加热，磁力搅拌反应5-36小时；(2)、打开步骤(1)中圆底烧瓶并加入1-5g聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯(PEGA)，将圆底烧瓶用橡胶塞密封，通入氮气10-60分钟，然后在30-150℃下油浴，磁力搅拌反应10-24小时，将反应制得的混合物用乙醚沉淀1-6次，得到的沉淀物即为嵌段共聚物PAA/PPEGA,将制得的沉淀物置于烘箱中，在20-70℃下干燥24-48小时至恒重，储存备用；二、用嵌段共聚物PAA/PPEGA对漆酶进行修饰：(1)、将0.3-0.6g共聚物PAA/PPEGA、7-11mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)在50mL的圆底烧瓶中用15-25ml二氯甲烷溶解，室温下搅拌反应20-70分钟；(2)、在步骤(1)制得的试剂中加入4-9gN-羟基琥珀酰亚胺(NHS),室温下反应24小时，用乙醚沉淀三次，制得活化的聚合物PAA/PPEGA-NHS,再将制得的PAA/PPEGA-NHS置于烘箱中，在25-80℃下干燥24-72小时至恒重备用；(3)、配制浓度为0.1-0.9mol/L，pH＝5-9的醋酸盐缓冲液(ABS缓冲液),称取10-60mg漆酶溶于20mLABS缓冲液中配制0.5-3mg/mL的漆酶储备液备用，称取100-400mgPAA/PPEGA-NHS，溶于10mLABS缓冲液中配制10-40mg/mL的PAA/PPEGA-NHS储备液备用；(4)、取10-15mL步骤(3)制备的漆酶储备液逐滴加入到搅拌的0.5-11mLPAA/PPEGA-NHS的储备液中，将上述制得的溶液在冰浴下搅拌反应4-12小时，然后用截留分子量为20000-50000的透析膜冰浴透析1-3天，用以除去过量的PAA/PPEGA-NHS，制得用嵌段共聚物PAA/PPEGA修饰后的漆酶(PAA/PPEGA-laccase)；三、用铜离子对PAA/PPEGA-laccase进行修饰：(1)、用ABS缓冲液配制8-20mmol/l的硫酸铜溶液，然后将步骤二中制得的PAA/PPEGA-laccase在硫酸铜溶液中于0-37℃下培养10-20小时，制得嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu2+/PAA/PPEGA-laccase)的混合溶液；(2)、将步骤(1)中制得的混合试剂利用截留分子量为500-1000的透析膜冰浴中透析，除去吸附不牢的铜离子，制得嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu2+/PAA/PPEGA-laccase)，将制得的Cu2+/PAA/PPEGA-laccase冷冻干燥条件下存储。本专利技术对Cu2+/PAA/PPEGA-laccase的催化活性和稳定性进行测定，分别对原漆酶和Cu2+/PAA/PPEGA-laccase的催化活性以及半衰期进行了表征测试，结果表明Cu2+/PAA/PPEGA-laccase的活性和稳定性有提高，其中催化活性提高了347％，稳定性提高了137％，表明对原漆酶的修饰，成功的提高了原漆酶的催化活性和稳定性。本专利技术涉及对经过嵌段共聚物PAA/PPEGA和铜离子修饰后的漆酶(Cu2+/PAA/PPEGA-laccase)的应用及催化活性和稳定性测定，具体工艺步骤如下：一、将Cu2+/PAA/PPEGA-laccase固定到石墨烯纸表面：(1)、用ABS缓冲液配制1-10mg/mL的Cu2+/PAA/PPEGA-laccase溶液。(2)、将1.0cm2-1.0m2的石墨烯纸浸泡于步骤(1)制备的溶液中，0-50℃条件下浸泡6-20个小时(3)、用流动的超纯水冲洗石墨烯纸表面，以除去表面固定不牢的Cu2+/PAA/PPEGA-laccase。(4)、用氮气吹干石墨烯纸，于0-60℃下保存备用。二、将原漆酶固定在石墨烯纸的表面，用以比较Cu2+/PAA/PPEGA-laccase固定后的催化活性、稳定性，以及重复利用情况：二、将原漆酶固定在石墨烯纸的表面，用以比较Cu2+/PAA/PPEGA-laccase固定后的催化活性、稳定性，以及重复利用情况：(1)、将20mgEDC、5mgNHS、20mg原漆酶溶解在在9mLABS缓冲液中；(2)、将1mg芘丁酸溶解到1mL二甲基甲酰胺中；(3)、将步骤(2)中制备的溶液逐滴加入到步骤(1)中的溶液中，于4℃下搅拌反应8小时；(4)、用截留分子量为1000的透析袋，在4℃下透析24小时，以除去过量的EDS和NHS；(5)采用与步骤一相同的工艺将，将芘修饰的漆酶固定在石墨烯纸表面；对固定在石墨烯纸上的Cu2+/PAA/PPEGA-laccase的活性进行测试，结果表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种漆酶的修饰方法，其特征在于具体工艺包括如下步骤：步骤一、通过可逆加成断裂链转移聚合合成嵌段共聚1物聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯:(1)、将20‑60mg可逆加成断裂链转移试剂、2‑10mg偶氮二异丁腈、0.2‑0.5g丙烯酸，在圆底烧瓶中用2‑5mL超纯水和3‑7mL二氧六环溶解，将圆底烧瓶用橡胶塞密封，通入氮气30‑60分钟以除去圆底烧瓶中的氧气，再将圆底烧瓶油浴在20‑90℃下加热，磁力搅拌反应5‑36小时；(2)、打开步骤(1)中圆底烧瓶并加入1‑5g聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯，将圆底烧瓶用橡胶塞密封，通入氮气10‑60分钟，然后在30‑150℃下油浴，磁力搅拌反应10‑24小时，将反应制得的混合物用乙醚沉淀1‑6次，得到的沉淀物即为聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯,将制得的沉淀物置于烘箱中，在20‑70℃下干燥24‑48小时至恒重，储存备用；步骤二、用聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯对漆酶进行修饰：(1)、将0.3‑0.6g聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯、7‑11mg 1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐在50mL的圆底烧瓶中用15‑25ml二氯甲烷溶解，室温下搅拌反应20‑70分钟；(2)、在步骤(1)制得的试剂中加入4‑9g N‑羟基琥珀酰亚胺,室温下反应24小时，用乙醚沉淀三次，制得活化的聚合物聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯‑N‑羟基琥珀酰亚胺,再将制得的聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯‑N‑羟基琥珀酰亚胺置于烘箱中，在25‑80℃下干燥24‑72小时至恒重备用；(3)、配制浓度为0.1‑0.9mol/L，pH＝5‑9的醋酸盐缓冲液,称取10‑60mg原漆酶溶于20mL醋酸盐缓冲液中配制0.5‑3mg/mL的原漆酶储备液备用，称取100‑400mg聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯‑N‑羟基琥珀酰亚胺，溶于10mL醋酸盐缓冲液中配制10‑40mg/mL的聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯‑N‑羟基琥珀酰亚胺储备液备用；(4)、取10‑15mL步骤(3)制备的漆酶储备液逐滴加入到搅拌的0.5‑11mL聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯‑N‑羟基琥珀酰亚胺的储备液中，将上述制得的溶液在冰浴下搅拌反应4‑12小时，然后用截留分子量为20000‑50000的透析膜冰浴透析1‑3天，用以除去过量的聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯‑N‑羟基琥珀酰亚胺，制得用聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯修饰后的漆酶；步骤三、用铜离子对用聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯修饰后的漆酶进行修饰：(1)、用醋酸盐缓冲液配制8‑20mmol/l的硫酸铜溶液，然后将步骤二中制得的用聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯修饰后的漆酶在硫酸铜溶液中于0‑37℃下培养10‑20小时，制得聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯和铜离子修饰后的漆酶的混合溶液；(2)、将步骤(1)中制得的混合试剂利用截留分子量为500‑1000的透析膜冰浴中透析，除去吸附不牢的铜离子，制得聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯和铜离子修饰后的漆酶，并冷冻干燥条件下存储。...

【技术特征摘要】
1.一种漆酶的修饰方法，其特征在于具体工艺包括如下步骤：步骤一、通过可逆加成断裂链转移聚合合成嵌段共聚1物聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯:(1)、将20-60mg可逆加成断裂链转移试剂、2-10mg偶氮二异丁腈、0.2-0.5g丙烯酸，在圆底烧瓶中用2-5mL超纯水和3-7mL二氧六环溶解，将圆底烧瓶用橡胶塞密封，通入氮气30-60分钟以除去圆底烧瓶中的氧气，再将圆底烧瓶油浴在20-90℃下加热，磁力搅拌反应5-36小时；(2)、打开步骤(1)中圆底烧瓶并加入1-5g聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯，将圆底烧瓶用橡胶塞密封，通入氮气10-60分钟，然后在30-150℃下油浴，磁力搅拌反应10-24小时，将反应制得的混合物用乙醚沉淀1-6次，得到的沉淀物即为聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯,将制得的沉淀物置于烘箱中，在20-70℃下干燥24-48小时至恒重，储存备用；步骤二、用聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯对漆酶进行修饰：(1)、将0.3-0.6g聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯、7-11mg1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐在50mL的圆底烧瓶中用15-25ml二氯甲烷溶解，室温下搅拌反应20-70分钟；(2)、在步骤(1)制得的试剂中加入4-9gN-羟基琥珀酰亚胺,室温下反应24小时，用乙醚沉淀三次，制得活化的聚合物聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯-N-羟基琥珀酰亚胺,再将制得的聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯-N-羟基琥珀酰亚胺置于烘箱中，在25-80℃下干燥24-72小时至恒重备用；(3)、配制浓度为0.1-0.9mol/L，pH＝5-9的醋酸盐缓冲液,称取10-60mg原漆酶溶于20mL醋酸盐缓冲液中配制0.5-3mg/mL的原漆酶储备液备用，称取100-400mg聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯-N-羟基琥珀酰亚胺，溶于10mL醋酸盐缓冲液中配制10-40mg/mL的聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯-N-羟基琥珀酰亚胺储备液备用；(4)、取10-15mL步骤(3)制备的漆酶储备液逐滴加入到搅拌的0.5-11mL聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯-N-羟基琥珀酰亚胺的储备液中，将上述制得的溶液在冰浴下搅拌反应4-12小时，然后用截留分子量为20000-50000的透析膜冰浴透析1-3天，用以除去过量的聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯-N-羟基琥珀酰亚胺，制得用聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯修饰后的漆酶；步骤三、用铜离子对用聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯修饰后的漆酶进行修饰：(1)、用醋酸盐缓冲液配制8-20mmol/l的硫酸铜溶液，然后将步骤二中制得的用聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯修饰后的漆酶在硫酸铜溶液中于0-37℃下培养10-20小时，制得聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯和铜离子修饰后的漆酶的混合溶液；(2)、将步骤(1)中制得的混合试剂利用截留分子量为500-1000的透析膜冰浴中透析，除去吸附不牢的铜离子，制得聚丙烯酸/聚(聚(乙二醇)甲基醚丙烯酸酯和铜离子修饰后的漆酶，并冷冻干燥条件下存储。2....

【专利技术属性】
技术研发人员：许元红，刘敬权，陈涛，
申请(专利权)人：青岛大学，
类型：发明
国别省市：山东;37