一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法，该方法使用冷休克表达载体pColdⅡ构建原核表达重组质粒，并导入到含有伴侣质粒的大肠杆菌Chaperone Competent Cell pG‑KJE8/BL21中进行重组蛋白表达。通过该方法，重组蛋白能够在上清中大量表达，易于后期纯化，能够快速获得产量高、纯度高、活力好的MnSOD。本发明专利技术的表达产物具有耐低温、稳定性好的特性，可大规模应用于生物、食品、医药、美容、农业、工业等领域，节约成本。

A cryogenic superoxide dismutase MnSOD from the source of deep sea sea cucumber and its preparation method

The invention discloses a deep sea cucumber from low temperature resistant superoxide dismutase MnSOD and its preparation method, the method of using cold shock expression vector of pCold to construct prokaryotic expression recombinant plasmid into E.coli Chaperone with partner Competent Cell pG KJE8/BL21 for recombinant protein expression. Through this method, the recombinant protein can be expressed in a large amount in the supernatant, easy to be purified later, and can quickly obtain MnSOD with high yield, high purity and good vitality. The expression product of the invention has the characteristics of low temperature resistance and good stability, and can be applied to fields such as biology, food, medicine, beauty, agriculture and industry in a large scale, so as to save cost.

【技术实现步骤摘要】
一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法
本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法。
技术介绍
超氧化物歧化酶(Superoxidedismutase)简称SOD，是一种广泛存在于自然界的生物酶，按所含金属种类不同主要可分为铜锌SOD、锰SOD和铁SOD三种。锰SOD主要存在于真核细胞的线粒体和原核细胞中，在植物的叶绿体基质和类囊体膜上也有存在，纯品呈粉红色，由4条或2条肽链组成。由于锰SOD定位于线粒体，因此被认为是抵御氧化压力的第一线。许多研究表明，氧自由基在肿瘤的发生发展过程中起重要作用，而锰SOD是最有效的具有抗肿瘤活性的抗氧化酶之一(曾跃平,刘洁,王宝玺.锰超氧化物歧化酶与肿瘤关系研究进展[J].癌症进展,2009,7(6):613-616.)。另外，锰超氧化物歧化酶还具有抗衰老、抗辐射、抗炎症，抑制肿瘤和癌症等重要的功能。临床研究表明，其对炎症、缺血再灌注损伤、辐射损伤均有一定疗效，还可减少抗癌药物对细胞和心脏的毒副作用(王峰,杨文杰,成子锋,等.人锰超氧化物歧化酶的扩增和表达研究[J].药物生物技术,2009(4):302-305.)。总之，由于锰SOD的重要作用，其具有很强的医用价值及临床应用前景。目前SOD的生产方式主要有以下四种:①利用动物血液提取法；②从植物中提取；③选用高产菌株进行微生物发酵法生产；④基因工程法获得。其中④是获得SOD的有效途径。目前的许多研究工作集中在优质SOD基因的选育上。深海生物生存环境恶劣，但是报道的超氧化物歧化酶相对较少，尤其是锰SOD，而通常的蛋白表达制备方法也多以包涵体的方式进行，表达的蛋白常常没有活性，不可回收或者要进行变复性回收。存在成功率低，操作繁琐，耗时长，产量低，酶活损失大等缺点。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对深海超氧化物歧化酶优质基因难以获取、蛋白制备过程变复性回收复杂繁琐、酶活损失大等不足的问题，提供了一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD及其制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种深海海参来源的超氧化物歧化酶MnSOD的编码蛋白，其具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相似或者同等功能的氨基酸序列。本专利技术还公开了一种编码上述蛋白的基因，记做PaMnSOD。进一步地，其具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术还公开了一种含有上述基因的pColdⅡ载体。本专利技术还公开了一种含有上述载体的ChaperoneCompetentCellpG-KJE8/BL21表达宿主细胞。本专利技术还公开了一种深海海参来源的超氧化物歧化酶MnSOD的制备方法，具体按照以下步骤实施：步骤1、Paelopatidessp.总RNA及cDNA的获得；步骤2、Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的获得和序列分析；步骤3、Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的可溶性表达与纯化。进一步地，所述步骤2中的Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的获得中所用的到的PCR反应体系为50μL，包括10μLPrimeSTARGXLBuffer，4μLdNTP，F和R引物各1μL，模板cDNA1μL，2μLGXLDNAPolymerase(TaKARa公司)，用H2O将总体积补至50μL。进一步地，所述PCR反应体系中的引物对为引物F和引物R，其中，引物F：CGGGATCCATGAAGGCTCCGTATGAAGGCCTGGA，其核苷酸序列如SEQIDNO.3所示；引物R：AACTGCAGTCACAATTCTTCATGTTTAGATGGC，其核苷酸序列如SEQIDNO.4所示；划线部分GGATCC代表BamHI酶切位点，CTGCAG代表PstI酶切位点。进一步地，所述步骤2中的Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的获得中所用的到的PCR反应条件为：98℃10s、55℃15s、68℃10s，30cycles，4℃保存。进一步地，所述步骤3中的纯化采用Ni-NTA柱纯化。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：通过该方法制备的重组蛋白克服了深海优质生物资源难以获取、蛋白变复性回收过程复杂繁琐、酶活损失大等不足，纯化后的蛋白具有耐低温、纯度高、活力好，温度适应范围广等特性，为该蛋白能广泛应用于生物、食品、医药、美容、农业等领域奠定基础。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术PaMnSOD基因重组表达的SDS-PAGE电泳图谱；其中，M:蛋白Marker；1：重组蛋白未诱导表达时菌体总蛋白；2：重组蛋白诱导表达后菌体总蛋白；3：重组蛋白在包涵体中的表达情况；4：重组蛋白在上清中的表达情况；5：经镍柱介质纯化所得的目的蛋白PaMnSOD；图2是本专利技术实施例PaMnSOD的热稳定性曲线图；其中，横坐标表示不同温度，纵坐标表示PaMnSOD的相对活性；图3是本专利技术实施例PaMnSOD的酸碱稳定性曲线图；其中，横坐标表示不同pH，纵坐标表示PaMnSOD的相对活性。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照分子克隆实验室手册(15、萨姆布鲁克，拉塞尔(著)，黄培堂(译)，《分子克隆实验指南》，科学出版社，2002年，第三版)中所述的实验条件，或按照试剂或仪器生产厂商所建议操作说明书条件进行。实施例1Paelopatidessp.总RNA及cDNA的获得：(1)样品采集深海海参Paelopatidessp.采自于马里亚纳海沟深渊海域(深度：6500m；纬度：10°57.1693’N，经度：141°56.1719’E)。(2)总RNA提取取50-100mg样品组织，用RNaseFREE实验用纸吸干样品表面残留的RNAlater并尽量切碎。添加1mlQIAzol，Ruptor进一步充分搅拌研磨样品。匀浆液室温下放置10min以上，随后，用QIAGEN(凯杰)总RNA提取试剂盒进行总RNA提取(操作见说明书)。经电泳检测RNA无降解后进行下一步的反转录合成cDNA。(3)cDNA合成使用TAKARA反转录试剂盒(PrimeScriptTM1stStrandcDNASynthesisKit)进行深海海参Paelopatidessp.总RNA到cDNA的反转录实验。操作详见产品说明书。得到的cDNA可用于实施例2中PCR扩增。其中，对于该样品而言，将样品在QIAzol中进行充分研磨很关键，有利于提高后期总RNA得率，经过各种总RNA试剂盒的使用比较，发现用QIAGEN(凯杰)试剂盒进行该样品的总RNA提取效果好。实施例2Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的克隆和序列分析(1)P本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD的编码蛋白，其特征在于，其具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相似或者同等功能的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD的编码蛋白，其特征在于，其具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有相似或者同等功能的氨基酸序列。2.编码权利要求1所述蛋白的基因，记做PaMnSOD。3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，其具有SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。4.含有权利要求2或3所述基因的pColdⅡ载体。5.含有权利要求4所述载体的ChaperoneCompetentCellpG-KJE8/BL21表达宿主细胞。6.一种深海海参来源的耐低温超氧化物歧化酶MnSOD的制备方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：步骤1、Paelopatidessp.总RNA及cDNA的获得；步骤2、Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的获得和序列分析；步骤3、Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的可溶性表达与纯化。7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2中的Paelopatidessp.超氧化物歧化酶PaMnSOD基因的...

【专利技术属性】
技术研发人员：李亚男，张海滨，孔雪，刘君，刘合露，
申请(专利权)人：中国科学院深海科学与工程研究所，
类型：发明
国别省市：海南,46