一种基于Primer3的多重PCR引物设计方法技术

本发明专利技术提供了一种基于Primer3的多重PCR引物设计方法，其包括：S1：获取目标DNA序列的原始序列；S2：Primer3对目标序列进行PCR引物设计，并生成候选引物；S3：用PE模型或SE模型对多重PCR引物进行评估，并筛选出合格的多重PCR引物；S4：改变引物筛选参数，再次对未能设计出引物的目标DNA序列进行设计和筛选，最终获得所有目标DNA序列的多重PCR引物。本发明专利技术可识别序列相距较近的目标序列并设计兼并引物，进而减少因相距较近的目标序列的引物相互干扰而导致的非特异性扩增；系统性评估所设计引物的特异性，减少因非特异性扩增、出现引物二聚体和发夹结构等原因导致的扩增失败，为多重PCR实验设计出特异性较强的多重PCR引物。

【技术实现步骤摘要】
一种基于Primer3的多重PCR引物设计方法
本专利技术涉及一种基于Primer3的多重PCR引物设计方法。
技术介绍
聚合酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)技术又称体外基因扩增技术，是目前广为使用的分子生物学技术，它是利用DNA聚合酶对特定基因在体外或试管内进行大量合成的技术。其基本工作原理就是以拟扩增的DNA分子为模板，以一对分别与模板互补的寡核苷酸片段为引物，在DNA聚合酶的作用下，按照碱基互补配对原则沿着模板链延伸直至完成新的DNA合成。不断重复这个过程，可使目的DNA片段得到扩增。顺着PCR技术的发展，产生出多种类的相关技术，其中多重PCR(MultiplexPCR)早在1988年就被用来快速检测人杜氏肌营养不良相关基因外显子的缺失情况，可大幅度提高PCR效率。同时，这种通过在同一PCR反应体系里提供两对或两对以上引物的PCR技术能够同时扩增出多个核苷酸片段。虽然多重PCR技术具有简便、高效、灵敏等优点，但是正因为是在反应过程中加入多对引物，必然会增加引物设计的难度以及针对不同扩增产物的最佳退火温度、延伸时间、循环次数等诸多复杂因素的抉择而极易导致非特异性扩增反应的发生。多重PCR引物的设计不仅考虑到引物与DNA模板结合的特异性问题，还要考虑引物与引物之间的相互干扰重组问题，而且随着引物的增加，多重PCR实验中引物的特异性大幅度减低。例如，假设一个反应管中同时存在20条引物，则可能的重组引物对数目可以达到210(如果要考虑上单个引物也能自身作为上下游引物的最坏的打算的话)。那么如何合理的设计出多重PCR实验所需要的引物对，是多重PCR实验成功与否的关键。Primer3是现在最广泛被使用的开源的PCR引物设计软件。它最基本的功能包括设计PCR引物和设计杂交探针，虽然它具有免费、开源、跨平台等优点，但它一次只能对一个目标序列进行设计引物，而且不能回避单核苷酸高频多态性位点，不能评估引物的特异性和计算简并碱基的计算；不能识别序列相距较近的目标序列并设计兼并引物；不能很好的对多条目标基因序列设计出合理的多重PCR引物。因此，如何提供一种能够减少非特异性扩增，设计出特异性较强的多重PCR引物的多重PCR引物设计方法成为了业界需要解决的问题。
技术实现思路
针对现有技术的缺点，本专利技术的目的是提供一种基于Primer3的多重PCR引物设计方法，其能够减少非特异性扩增，设计出特异性较强的多重PCR引物。为了实现上述目的，本专利技术提供了一种基于Primer3的多重PCR引物设计方法，多重PCR引物设计方法包括：S1：获取目标DNA序列的原始序列；S2：Primer3对目标序列进行PCR引物设计，并生成候选引物；S3：用PE模型或SE模型对多重PCR引物进行评估，并筛选出合格的多重PCR引物；S4：改变引物筛选参数，再次对未能设计出引物的目标DNA序列进行设计和筛选，最终获得所有目标DNA序列的多重PCR引物。本专利技术通过融合PE模型和SE模型，解决多重PCR引物设计中，因特异性等问题导致的非特异性扩增问题；能快速设计出高特异性高灵敏性的多重PCR引物。根据本专利技术另一具体实施方式，多重PCR引物设计方法进一步包括兼并引物的设计，兼并引物的设计包括：若两目标序列区域相距很近，则两目标序列的引物会因为相互干扰而出现非特异性扩增，导致扩增失败；因此需将两目标区域合并设计兼并引物。本方案中，非特异性扩增的发生是因为两相近的上游引物或下游引物与模板DNA链相结合，形成新的上下游引物关系；有时甚至前一个目标序列的下游引物和后一个目标序列的上游引物也能形成新的上下游引物关系。根据本专利技术另一具体实施方式，步骤S1中，获取目标DNA序列的原始序列包括：构建目标序列的坐标文件，并使坐标文件的每一行包括一个基因序列坐标。根据本专利技术另一具体实施方式，基因序列坐标的形式为bed文件形式，bed文件形式为：染色体位置，制表符，起始坐标，制表符，终止坐标。本方案中，获取目标DNA序列的参考基因组为hg19，其为人类(Homosapiens)标准参考基因组(GRCh37/hg19)，是国际通用的作为筛选目标序列突变位点或SNP位点的参考基因序列，即NCBIGenBankassemblyaccession：GCA_000001405.1。根据本专利技术另一具体实施方式，步骤S3中，PE模型对多重PCR候选引物的筛选参数包括：GC含量：指引物序列中GC的含量，只是DNA序列的一个重要特征，直接影响退火强度，设定为：20％～80％。TM值：指寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度下，50％寡核苷酸双链解链温度，设定为：59℃～61℃。Primersize：指引物长度，由于反应的特异性，温度和退火时间都部分依赖于引物的长度，设定为：18～27。Ampliconsize：指扩增子长度，DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列，设定为：200～260。Target_side：指目标序列左右两端设计引物的局域长度，设定：100。buffer：指引物3’到目标区域的缓冲区域，设定：5。根据本专利技术另一具体实施方式，步骤S3中，PE模型或SE模型对多重PCR引物进行评估，并筛选出合格的多重PCR引物中的PE模型和SE模型为预测模型，通过代码和算法实现PCR实验的过程，并预测多重PCR引物的特异性，预防多重PCR实验的引物非特异性扩增情况；预测过程通过代码实现。根据本专利技术另一具体实施方式，步骤S3中，用PE模型或SE模型对多重PCR引物进行评估，并筛选出合格的多重PCR引物中的引物评估和筛选候选引物包括：对候选引物的特异性进行评估；对候选引物是否会形成引物二聚体等结构进行评估；对候选引物的单核苷酸高频多态性位点情况进行评估；对候选引物的退火温度，解链温度，GC值进行评估；筛除解链温度不在设定范围内的候选引物；筛除GC值不在设定范围内的候选引物；筛除单核苷酸高频多态性位点超过阈值的候选引物；筛除没有特异性的候选引物；筛除会形成引物二聚体等结构的候选引物；筛除存在风险的候选引物。本方案中，对候选引物的退火温度，解链温度，GC值进行评估包括：对引物的TM值进行计算，计算公式为：TM＝△H°/(△S°+RlnCT)；其中△H°和△S°分别为杂交反应的标准焓变和熵变，R为气体常数1.987cal/kmol，CT为DNA分子的摩尔浓度(当DNA分子为非对称序列时其摩尔浓度取CT/4)。对候选引物的单核苷酸高频多态性位点情况进行评估包括对目标DNA序列提取DNA多态性数据中的高频多态性位点。提取DNA多态性数据中的高频多态性位点包括：从DNA多态性数据中提取与目标DNA序列的坐标文件相对应的高频多态性位点。根据本专利技术另一具体实施方式，步骤S4中，获得所有目标DNA序列的多重PCR引物的方法包括：对于因为GC值，TM值，缺少特异性导致不能设计出引物的目标DNA序列，在不影响之前已经设计好的引物的前提下，通过改变扩增子的长度，目标序列左右两端设计引物的局域长度来增加候选引物的数量，选择出合适的候选引物；如果还不能选出合适的引物，通过合理扩大TM值和GC值来筛选出合适的候选引物；对于因为单核苷酸高频多态性位点超过阈值而不能设计出合适的候选引物的目标序列，在不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Primer3的多重PCR引物设计方法，其中，所述多重PCR引物设计方法包括：S1：获取目标DNA序列的原始序列；S2：Primer3对目标序列进行PCR引物设计，并生成候选引物；S3：用PE模型或SE模型对多重PCR引物进行评估，并筛选出合格的多重PCR引物；S4：改变引物筛选参数，再次对未能设计出引物的目标DNA序列进行设计和筛选，最终获得所有目标DNA序列的多重PCR引物。

【技术特征摘要】
1.一种基于Primer3的多重PCR引物设计方法，其中，所述多重PCR引物设计方法包括：S1：获取目标DNA序列的原始序列；S2：Primer3对目标序列进行PCR引物设计，并生成候选引物；S3：用PE模型或SE模型对多重PCR引物进行评估，并筛选出合格的多重PCR引物；S4：改变引物筛选参数，再次对未能设计出引物的目标DNA序列进行设计和筛选，最终获得所有目标DNA序列的多重PCR引物。2.如权利要求1所述的多重PCR引物设计方法，其中，所述多重PCR引物设计方法进一步包括兼并引物的设计，所述兼并引物的设计包括：若两目标序列区域相距很近，则两目标序列的引物会因为相互干扰而出现非特异性扩增，导致扩增失败；因此需将两目标区域合并设计兼并引物。3.如权利要求2所述的多重PCR引物设计方法，其中，所述步骤S1中，所述获取目标DNA序列的原始序列包括：构建目标序列的坐标文件，并使所述坐标文件的每一行包括一个基因序列坐标。4.如权利要求3所述的多重PCR引物设计方法，其中，所述基因序列坐标的形式为bed文件形式，所述bed文件形式为：染色体位置，制表符，起始坐标，制表符，终止坐标。5.如权利要求2所述的多重PCR引物设计方法，其中，所述步骤S3中，所述PE模型对多重PCR候选引物的筛选参数包括：GC含量：指引物序列中GC的含量，只是DNA序列的一个重要特征，直接影响退火强度，设定为：20％～80％。TM值：指寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度下，50％寡核苷酸双链解链温度，设定为：59℃～61℃。Primersize：指引物长度，由于反应的特异性，温度和退火时间都部分依赖于引物的长度，设定为：18～27。Ampliconsize：指扩增子长度，DNA或RNA扩增后的一段核苷酸序列，设定为：200～260。Target_side：指目标序列左右两端设计引物的局域长度，设定...

【专利技术属性】
技术研发人员：施玉健，周天亮文，值奇欢，兰兆吉，邝建宇，
申请(专利权)人：拓普基因科技广州有限责任公司，
类型：发明
国别省市：广东,44