一种过表达MGST1基因人肺腺癌细胞的构建方法及其应用技术

一种构建稳定过表达MGST1基因细胞及初步研究其生物学特性的方法，其包括如下步骤：(1)通过PCR合成人的MGST1目的基因片段。(2)将MGST1目的基因片段与真核质粒pcDNA3连接，形成真核重组质粒。将上述真核重组质粒转化到感受态细菌细胞中进行培养，然后挑选单克隆进行PCR扩增凝胶电泳筛选出阳性克隆。(3)抽提上一步中筛选出来的阳性克隆，利用限制性内切酶双酶切图谱分析所建的真核重组质粒，并进行DNA序列分析。(4)将上一步中获得的序列正确的重组质粒pcDNA3‑MGST1转染SPC‑A‑1人肺腺癌细胞，并用G418筛选稳定过表达MGST1的SPC‑A‑1细胞，观察稳定过表达MGST1的细胞生物学特性。结果表明稳定过表达MGST1可促进细胞的增殖、抑制细胞的凋亡和增加细胞克隆形成能力。

【技术实现步骤摘要】
一种过表达MGST1基因人肺腺癌细胞的构建方法及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体的，涉及一种能够过表达MGST1基因的人肺腺癌细胞的构建方法及其应用。
技术介绍
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，发病率和死亡率在我国及全世界均高居首位。肺癌按病理组织类型分为两种，即非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer，NSCLC)和小细胞肺癌(smallcelllungcancer，SCLC)，其中NSCLC约占肺癌类型的80％。肺腺癌是最常见的NSCLC组织类型之一，其发现时常处于晚期，预后较差，因肺腺癌而造成的死亡数居我国所有癌症相关性死亡数的第一位。针对肺癌的治疗手段主要有手术、化疗、放疗、靶向治疗和生物治疗，虽然近年疗效有较大的进展，但5年生存率仍不足15％，预后较差。因此探索肺腺癌的发病机制，探寻治疗肺腺癌新的治疗靶点具有重大意义。基因工程(geneticengineering)，又称为基因重组技术，是以分子遗传学为理论基础在体外对DNA进行操作的一门技术，广泛用于疾病基础研究、基因免疫、基因治疗、基因疫苗等。其三要素分别为：载体、目的基因、工具酶。而真核表达载体是基因工程中用于构建真核基因表达系统的一种载体，近几十年来，各国学者围绕真核表达载体进行了各种疾病、基因等相关研究，在基因工程方面做了大量工作，为医学科学研究开辟了崭新途径。MGST1基因编码的蛋白在肝脏中高表达，通过催化亲核性的谷胱甘肽和各种亲电子试剂的结合反应发挥解毒作用，因此，MGST1在肿瘤化疗药物耐药方面研究较多。近几年研究报道MGST1在食管癌、上皮性卵巢癌、前列腺癌等多种恶性肿瘤中表达增高，其机制未阐明，同时其在人肺癌中的研究未见报道。鉴于以上MGST1在其他的恶行肿瘤中高表达的现象，以及基因重组技术的优势，同时为了对肺腺癌细胞进行更多的研究，本专利技术采用基因重组技术，针对MGST1基因，构建重组真核表达载体pcDNA3-MGST1，并将其转染低表达MGST1的人肺腺癌细胞，构建稳定转染MGST1基因的细胞株，为研究MGST1功能提供了良好工具，亦为进一步研究MGST1基因在肺腺癌等恶性肿瘤中的生物学功能打下基础，同时也为研究肺腺癌及其它恶性肿瘤中MGST1基因的功能提供有效实验方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的稳定过表达真核重组质粒的肺腺癌细胞及其制备方法，并证明所述稳定过表达重组质粒pcDNA3-MGST1的肺腺癌细胞为功能研究提供了良好的实验工具，也为研究人肺腺癌及其它恶性肿瘤中MGST1基因的功能提供有效实验方法。人MGST1基因已在GenBank注册，注册号NM_001260511.1，定位于12p12.3，全长937bp，编码155个氨基酸，其核苷酸序列为图10中所述。我们前期研究结果发现人MGST1基因在人肺腺癌组织中高表达。本专利技术所述的真核重组质粒，由图11所示的核苷酸序列中的MGST1目的片段与真核载体pcDNA3构建而成，所述MGST1目的片段是起始密码子下游84bp～551bp的核苷酸序列。一种pcDNA3-MGST1真核重组质粒转染SPC-A-1细胞的方法，其包括如下步骤：(1)通过PCR(聚合酶链式反应)合成人的MGST1目的基因片段；(2)将上述获得的MGST1目的基因片段与真核质粒pcDNA3连接，形成真核重组质粒，其中该插入MGST1目的基因的酶切位点分别为HindⅢ和KpnⅠ。将上述真核重组质粒转化到感受态细菌细胞中进行培养，然后挑选出单克隆进行PCR凝胶电泳进行阳性克隆的筛选；(3)抽提上一步中筛选出来的阳性克隆，利用限制性内切酶酶切图谱分析所建的真核重组质粒，并进行DNA序列分析。(4)将上一步中获得序列正确的重组质粒pcDNA3-MGST1转染SPC-A-1人肺腺癌细胞，并用G418筛选稳定过表达MGST1的SPC-A-1细胞，观察稳定过表达MGST1的细胞生物学特性。(5)实验表明，稳定过表达MGST1可促进人肺腺癌细胞SPC-A-1的增殖，抑制人肺腺癌细胞SPC-A-1的凋亡。由此可见，采用本专利技术的构建稳定过表达MGST1基因细胞的方法，有助于研究MGST1基因功能，并且为研究MGST1基因在人肺腺癌中发病的作用机制提供了分子生物学工具。附图说明图1为本专利技术真核重组质粒的载体pcDNA3的结构示意图。图2为电泳测试图谱。其中，A为本专利技术目的MGST1DNA片段PCR扩增产物的电泳图谱，B为筛选重组质粒pcDNA3-MGST1转入大肠杆菌的阳性克隆的电泳图谱，C为本专利技术真核重组质粒pcDNA3-MGST1的酶切鉴定图谱，D为本专利技术真核重组质粒pcDNA3-MGST1的测序图谱。图3为本专利技术真核重组质粒pcDNA3-MGST1的人肺腺癌细胞SPC-A-1显微镜下照片。其中，A图为阴性对照组；B图为转染组pcDNA3；C图转染组pcDNA3-MGST1。图4为本专利技术稳定过表达MGST1的人肺腺癌细胞SPC-A-1中MGST1mRNA的表达柱状图。图5为本专利技术稳定过表达MGST1的人肺腺癌细胞SPC-A-1中MGST1蛋白的表达western-blot电泳条带图。图6为稳定过表达MGST1实验组的人肺腺癌细胞SPC-A-1和稳定转染空载体pcDNA3的对照组的人肺腺癌细胞SPC-A-1的增殖图。图7为稳定过表达MGST1实验组的人肺腺癌细胞SPC-A-1和稳定转染空载体pcDNA3的对照组的人肺腺癌细胞SPC-A-1的平板克隆形成图及柱状图。图8为H2O2诱导稳定过表达MGST1实验组的人肺腺癌细胞SPC-A-1和H2O2诱导稳定转染空载体pcDNA3的对照组的人肺腺癌细胞SPC-A-1的流式凋亡图及凋亡分布表。图9为H2O2诱导稳定过表达MGST1实验组的人肺腺癌细胞SPC-A-1和H2O2诱导稳定转染空载体pcDNA3的对照组的人肺腺癌细胞SPC-A-1的caspase凋亡蛋白western-blot电泳条带图。图10为MGST1全长序列。图11为MGST1编码区。以下将结合附图对本专利技术的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本专利技术的目的、特征和效果。需要说明的是，下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件、实验室手册(NewYork:CoLdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中的条件、按照制造厂商所建议的条件。具体实施方式1：构建重组真核表达载体pcDNA3-MGST11、MGST1目的基因的克隆。(1)设计MGST1过表达的引物。根据GeneBank的编码序列，用primerpremier5软件设计MGST1过表达引物的上游引物：5'-CCCAAGCTTGGCTTGCTGCTTCCTCCTC-3'(含HindIII限制酶切位点CCCAAGCTT)，和下游引物：5'-CGGGGTACCCCTCTGCTCCCCTCCTACCT-3'(含KpnI限制酶切位点CGGGGTACC)(2)通过PCR合成MGST1目的基因。PCR反应的条件和体系设定如下：反应条件：预变性：98℃10s；变性：98℃10s，退火：60℃15s，延伸：72℃45s，共33个循环；4℃保存。反应体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建稳定过表达MGST1基因细胞的方法，其包括如下步骤：(1)通过PCR(聚合酶链式反应)合成人的MGST1目的基因片段；(2)将上述获得的MGST1目的基因片段与真核质粒pcDNA3连接，形成真核重组质粒，其中该插入MGST1目的基因的酶切位点分别为Hind III和Kpn I。将上述真核重组质粒转化到感受态细菌中进行培养，然后挑选出单克隆进行PCR凝胶电泳进行阳性克隆的筛选；(3)抽提上一步中筛选出来的阳性克隆，利用限制性内切酶双酶切图谱分析所建的真核重组质粒，并进行DNA序列分析。(4)将上一步中获得的序列正确的重组质粒pcDNA3‑MGST1转染SPC‑A‑1人肺腺癌细胞，并用G418筛选稳定过表达MGST1的SPC‑A‑1细胞，观察稳定过表达MGST1的细胞生物学特性。

【技术特征摘要】
1.一种构建稳定过表达MGST1基因细胞的方法，其包括如下步骤：(1)通过PCR(聚合酶链式反应)合成人的MGST1目的基因片段；(2)将上述获得的MGST1目的基因片段与真核质粒pcDNA3连接，形成真核重组质粒，其中该插入MGST1目的基因的酶切位点分别为HindIII和KpnI。将上述真核重组质粒转化到感受态细菌中进行培养，然后挑选出单克隆进行PCR凝胶电泳进行阳性克隆的筛选；(3)抽提上一步中筛选出来的阳性克隆，利用限制性内切酶双酶切图谱分析所建的真核重组质粒，并进行DNA序列分析。(4)将上一步中获得的序列正确的重组质粒pcDNA3-MGST1转染SPC-A-1人肺腺癌细胞，并用G418筛选稳定过表达MGST1的SPC-A-1细胞，观察稳定过表达MGST1的细胞生物学特性。2.如权利要求1所述的构建稳定过表达MGST1基因细胞的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的MGST1目的基因片段的获取包括如下步骤：Step1：设计MGST1过表达的引物。Step2：通过PCR合成MGST1目的基因。Step3：纯化回收PCR产物。3.如权利要求2所述的构建稳定过表达MGST1基因细胞的方法，其特征在于：所述的MGST1过表达的引物为上游引物：5′-CCCAAGCTTGGCTTGCTGCTTCCTCCTC-3′(含HindIII限制酶切位点CCCAAGCTT)下游引物：5′-CGGGGTACCCCTCTGCTCCCCTCCTACCT-3′(含KpnI限制酶切位点CGGGGTACC)。4.如权利要求2所述的构建稳定过表...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋鑫，曾宝真，葛春蕾，孟旭东，
申请(专利权)人：信雅生物科技苏州有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32