一种制备同时敲除CD163基因和CD13基因的猪成纤维细胞的方法技术

本发明专利技术提供一种双基因敲除载体系统，所述载体系统包括CD163基因敲除载体和CD13基因敲除载体，其中：所述CD163基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑3任一项所示；所述CD13基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4‑6任一项所示；所述CD163基因敲除载体与所述CD13基因敲除载体的载体骨架选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2。通过上述载体系统可以简单、快速、高效地定点同时敲除CD163基因和CD13基因。

【技术实现步骤摘要】
一种制备同时敲除CD163基因和CD13基因的猪成纤维细胞的方法
本专利技术涉及基因编辑领域，具体而言，涉及一种制备同时敲除CD163基因和CD13基因的猪成纤维细胞的方法。
技术介绍
猪生殖与呼吸综合征(porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是由猪生殖与呼吸综合征病毒(porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的以猪厌食、发热，妊娠母猪早产、晚期流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等繁殖障碍及仔猪和生长猪的呼吸系统疾病和高度死亡性为主要特征的一种高度接触性传染病。因该病在临床上表现为耳部皮肤紫绀，所以又被称为“蓝耳病”。该病于1987年首次在美国被发现，紧接着于1989年在欧洲爆发，1995年底在中国大陆首次爆发，猪群的感染率高达90％，给养猪业带来了极大的经济损失，已成为世界范围内一种严重危害养猪业的传染病。PRRSV在体内主要感染分化良好的猪肺泡巨噬细胞(porcinealveolarmacrophages，PAM)。PRRSV侵染靶细胞的先决条件是与宿主细胞吸附，而宿主细胞表面的受体是完成这种吸附过程必不可少的。研究发现，硫酸乙酰肝素(HeparinSulphate,HS)、唾液酸粘附素(Sialoadhesin,Sn)和CD163(ClusterofDifferentiation163)分子是PAM上存在的能与PRRSV结合的三个重要受体分子。其中，CD163是一种富含半胱氨酸的清道夫受体，是典型的Ⅰ型糖基化蛋白，也是一种巨噬细胞分化的抗原，分子大小是130kD，固又被称为M130蛋白。CD163起初是作为巨噬细胞和单核细胞的特异性鉴别蛋白质被认识的，在肺、脾脏、肝脏、淋巴集结和胸腺组织的巨噬细胞中都有表达。有研究表明，在PRRSV非易感细胞系(BHK-21和PK-15)中转染表达CD163分子可以使这些细胞系感染PRRSV并在细胞内产生子代病毒粒子，抗人CD163的抗体可以阻断PRRSV的感染，表明CD163是该病毒的必需受体。CD163蛋白结构域SRCR5是病毒感染细胞所必需的，而氨基端的4个SRCR和胞质尾部是非必需的，其中SRCR5结构域正是由CD163第7外显子所编码。因此，研究CD163基因修饰猪可以为CD163受体是否是PRRSV感染过程中的重要角色提供必要证据。猪流行性腹泻(porcineepidemicdiarrhea，PED)是一种由猪流行性腹泻病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的高度传染性肠道疾病。任何年龄的猪均可感染，对仔猪影响尤其严重，病死率非常高，特别对于7日龄内的新生仔猪，在缺乏有效母源抗体下，死亡率可高达100％；对成年的怀孕母猪来说，感染后繁殖性能受到影响，如怀孕早期的母猪感染后会出现流产，受孕率降低；育肥猪感染后体重下降。最近的研究表明PEDV主要通过与猪小肠黏膜上皮细胞中的CD13(APN)结合感染仔猪。CD13作为PEDV侵入细胞的必要结合受体意义重大，这为抗流行性腹泻病毒猪的新品种培育提供新思路，即通过敲除猪的APN基因来阻止PEDV对猪的感染。因此，建立一种可以快速、准确、有效地同时敲除猪CD163基因和CD13基因的方法，获取敲除猪CD163基因和CD13基因的猪成纤维细胞或猪在研究猪蓝耳病和猪流行腹泻腹泻以及抗病猪育种方面具有重要的意义。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的第一目的在于提供一种双基因敲除载体系统，所述基因敲除载体系统包括CD163基因敲除载体和CD13基因敲除载体，通过上述载体系统可以简单、快速、高效地定点敲除CD163基因和CD13基因。本专利技术的第二目的在于提供一种制备同时敲除CD163基因和CD13基因的猪成纤维细胞的方法，通过所述方法可以简单、快速、高效地获得CD163基因和CD13基因纯合敲除且不携带任何外源标记的猪成纤维细胞，对研究猪蓝耳病、猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。本专利技术的第三目的在于提供根据上述方法制备而成的同时敲除CD163基因和CD13基因的猪成纤维细胞，所述猪成纤维细胞纯合敲除CD163和CD13基因且不携带外源标记，对研究猪蓝耳病、猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。本专利技术的第四目的在于提供一种制备同时敲除CD163基因和CD13基因的基因编辑猪的方法，通过该方法可以简单、高效地获得CD163基因和CD13基因纯合敲除基因编辑猪，对研究猪蓝耳病、猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种双基因敲除载体系统，所述载体系统包括CD163基因敲除载体和CD13基因敲除载体，其中：所述CD163基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO：1-3任一项所示，优选地，如SEQIDNO：1所示；所述CD13基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO：4-6任一项所示，优选地，如SEQIDNO：4所示；所述CD163基因敲除载体与所述CD13基因敲除载体的载体骨架选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2。传统的基因敲除系统主要以ZFN和TALEN技术为基础，需要通过复杂的操作以及花费大量精力才能将靶基因敲除。而本专利技术上述基因敲除载体属于CRISPR基因编辑系统，利用CRISPR技术对靶基因进行定点敲除，从整体上极大地降低了基因敲除的操作难度，提高了敲除的效率；同时，本专利技术通过一次操作实现双基因编辑并且没有引入外源标记基因，具有效率高、精确性高、操作简单及安全性高的优势。另外一方面，本专利技术对针对CD163基因和CD13基因敲除的靶序列gRNA进行了优化，从多条靶序列中筛选获得敲除效率最高的靶序列，克服了CRISPR基因编辑系统在敲除过程中脱靶率高的缺陷，进一步提高打靶的效率，从而可以在短时间内快速获得敲除靶基因CD163基因和CD13基因的纯合子。在一些实施方式中，所述CD163基因敲除载体与所述CD13基因敲除载体的载体骨架为CRISPR/Cas9，优选地，所述CRISPR/Cas9选自pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551和pX552，更优选地，所述CRISPR/Cas9为pX330。本专利技术还涉及一种制备同时敲除CD163基因和CD13基因的猪成纤维细胞的方法，所述方法包括：(1)构建上述双基因敲除载体系统；(2)将所述基因敲除载体系统转入猪成纤维细胞中，鉴定获得纯合敲除CD163和CD13基因的单克隆细胞。本专利技术上述方法以前述基因敲除载体为基础建立而成，通过所述方法可以简单、快速、高效地获得CD163基因和CD13基因纯合敲除且不携带任何外源标记的猪成纤维细胞，对研究猪蓝耳病、猪流行性腹泻以及猪的抗病育种具有重要意义。在一些实施方式中，所述猪成纤维细胞为猪胎儿成纤维细胞。在一些实施方式中，所述步骤(1)具体包本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种双基因敲除载体系统，其特征在于，所述载体系统包括CD163基因敲除载体和CD13基因敲除载体，其中：所述CD163基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1‑3任一项所示，优选地，如SEQ ID NO：1所示；所述CD13基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：4‑6任一项所示，优选地，如SEQ ID NO：4所示；所述CD163基因敲除载体与所述CD13基因敲除载体的载体骨架选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2。

【技术特征摘要】
1.一种双基因敲除载体系统，其特征在于，所述载体系统包括CD163基因敲除载体和CD13基因敲除载体，其中：所述CD163基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO：1-3任一项所示，优选地，如SEQIDNO：1所示；所述CD13基因敲除载体包括基因编辑载体骨架以及连接到该载体骨架上的一段DNA片段，所述DNA片段的核苷酸序列如SEQIDNO：4-6任一项所示，优选地，如SEQIDNO：4所示；所述CD163基因敲除载体与所述CD13基因敲除载体的载体骨架选自CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas9n、CRISPR/Cpf1或CRISPR/C2c2。2.根据权利要求1所述的载体系统，其特征在于，所述CD163基因敲除载体与所述CD13基因敲除载体的载体骨架为CRISPR/Cas9，优选地，所述CRISPR/Cas9选自pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551和pX552，更优选地，所述CRISPR/Cas9为pX330。3.一种制备同时敲除CD163基因和CD13基因的猪成纤维细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)构建权利要求1或2所述双基因敲除载体系统；(2)将所述基因敲除载体系统转入猪成纤维细胞中，通过筛选和鉴定获得纯合敲除CD163基因和CD13基因的单克隆细胞。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述猪成纤维细胞为猪胎儿成纤维细胞。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括：将互补的寡核苷酸单链退火形成双链，与经过酶切的载体骨架连接，筛选获得阳性克隆即得CD163基因敲除载体，所述互补的寡核苷酸单链的序列如SEQIDNO：7-8所示，或者SEQIDNO：9-10所示，或者SEQIDNO：11-12所示；将互补的寡核苷酸单链退火形成双链，与经过酶切的载体骨架连接，筛选获得阳性克隆即得CD13基因敲除载体，所述互补的寡核苷酸单链的序列如SEQIDNO：13-14所示，或者如SEQIDNO：15-16所示，或者如S...

【专利技术属性】
技术研发人员：李奎，牟玉莲，刘志国，李巨浪，徐奎，魏迎辉，葛长利，蔡雪辉，王龙，陈其美，邱阳，
申请(专利权)人：山东蓝思种业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37