凝血酶结合抗体分子及其用途制造技术

本发明专利技术涉及分离的抗体，其识别凝血酶的exosite 1表位，并选择性抑制凝血酶，而不促进出血。这些抗体分子可用于治疗和预防血栓形成、栓塞及其他由凝血酶介导的病症。

【技术实现步骤摘要】
凝血酶结合抗体分子及其用途本专利技术是申请日为2012年12月14日、申请号为201280061294.8、专利技术名称为“凝血酶结合抗体分子及其用途”的分案申请。
本专利技术涉及抑制凝血酶的抗体分子。
技术介绍
血液凝固是防止受损血管出血(止血)的重要过程。然而，阻塞血液流经血管(血栓形成)或脱落后沉积在身体内别处的血管(血栓栓塞)的血凝块对健康是严重的威胁。有很多抗凝血疗法可供治疗病理性血液凝固。这些疗法的通病是增加的出血风险(Mackman(2008)Nature451(7181):914-918)。许多抗凝剂治疗窗口狭窄，介于阻止血栓形成和引起出血的剂量之间。该窗口经常进一步受限于个体病人中的反应差异。
技术实现思路
本专利技术涉及预料不到的发现，即识别凝血酶exosite1表位的抗体分子选择性抑制凝血酶，而不促进出血。这些抗体分子可用于治疗和预防血栓形成、栓塞及其他由凝血酶介导的病症。本专利技术一方面提供了分离的抗体分子，其特异性结合凝血酶的exosite1。分离的抗exosite1抗体分子可在体内抑制凝血酶，而不促进或大幅促进出血(bleeding)或溢血(haemorrhage)，即该抗体分子不抑制或大幅抑制对血管损伤的正常生理反应(即止血)。例如，止血不会被抗体分子抑制或会被其最低程度地抑制(即微小程度地抑制，不会影响病人的健康或需要进一步干预)。出血不会被抗体分子增加或会被其最低程度地增加。exosite1(又名“阴离子结合exosite1”和“纤维蛋白原识别exosite”)是凝血酶分子上典型的次级结合位点(参见例如JamesA.Huntington,2008,StructuralInsightsintotheLifeHistoryofThrombin,inRecentAdvancesinThrombosisandHemostasis2008,editors；K.TanakaandE.W.Davie,SpringerJapanKK,Tokyo,pp.80-106)。exosite1形成于成熟凝血酶中，但不形成于凝血酶原中(参见例如Andersonetal(2000)JBC277516428-16434)。exosite1参与识别凝血酶底物，例如纤维蛋白原，但远离催化活性位点。多种凝血酶结合因子结合exosite1，包括抗凝十二肽水蛭原(hirugen)(Naskietal1990JBC26513484-13489)、因子V、因子VIII、血栓调解蛋白(蛋白C和TAFI激活的辅因子)、纤维蛋白原、PAR1和纤维蛋白(因子XIII激活的辅因子)。抗exosite1抗体可与成熟的人凝血酶exosite1结合。人前凝血酶原(preprothrombin)的序列如SEQIDNO:1所示。人凝血酶原具有SEQIDNO:1的44-622残基的序列。成熟的人凝血酶原具有314-363残基(轻链)和364-622残基(重链)的序列。在一些实施方案中，抗exosite1抗体也可结合来自其他物种的成熟凝血酶的exosite1。来自其他物种的凝血酶序列是本领域已知的，并可在公共数据库如Genbank中获得。来自其他物种的凝血酶序列中的对应残基可利用序列比对工具很容易地鉴别。本文所示凝血酶残基的编号方案是本领域常规的，基于糜蛋白酶模板(BodeWetalEMBOJ.1989Nov；8(11):3467-75)。凝血酶具有相对于糜蛋白酶的插入环，用小写字母顺序标出。成熟的人凝血酶exosite1在SEQIDNO:1中以下划线标出，可包括如下残基：M32、F34、R35、K36、S36a、P37、Q38、E39、L40、L65、R67、S72、R73、T74、R75、Y76、R77a、N78、E80、K81、I82、S83、M84、K109、K110、K149e、G150、Q151、S153和V154。在一些实施方案中，位于这些残基中任一个附近(即0.5nm或1nm内)的其他凝血酶残基也可被认为是exosite1的部分。抗exosite1抗体可结合表位，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或多于20个exosite1残基。优选地，抗exosite1抗体结合全部由exosite1残基组成的表位。例如，抗exosite1抗体可结合表位，其包含选自人凝血酶的M32、F34、S36a、P37、Q38、E39、L40、L65、R67、R73、T74、R75、Y76、R77a、I82和Q151的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或全部16个残基，或来自其他物种的凝血酶的等价残基。在一些优选实施方案中，表位可以包含凝血酶残基Q38、R73、T74、Y76和R77a以及任选地一个或多个其他残基。本文所述的抗exosite1抗体分子特异性针对凝血酶exosite1，并且相对于其他表位，例如来自成熟凝血酶之外的哺乳动物蛋白的表位，该抗体与该表位以高亲和力结合。例如，抗exosite1抗体分子对凝血酶exosite1的亲和力比对其他表位高至少500倍，至少1000倍或至少2000倍。优选地，本文所述的特异性针对exosite1的抗体分子可以结合成熟凝血酶，但与凝血酶原不结合或基本不结合。不受任何理论约束，抗exosite1抗体可能无法接近止血性血块核心内的凝血酶，因此无法通过破坏血管损伤位点的正常凝血酶功能影响止血。然而，由于抗exosite1抗体仍然结合血块表面上和外壳里的凝血酶，血栓形成被阻止，即非止血性血块蔓延被阻止。抗exosite1抗体分子对exosite1的解离常数可小于50nM、小于40nM、小于30nM、小于20nM、小于10nM或小于1nM。例如，抗体分子对exosite1的亲和力可以是0.1-50nM，例如0.5-10nM。适合的抗exosite1抗体分子对凝血酶exosite1的亲和力可以是例如约1nM。抗exosite1抗体分子的结合动力学和亲和力(以平衡解离常数Kd表示)可以使用标准技术例如表面离子共振，如使用BIAcore分析来确定。本文所述的抗exosite1抗体分子可以是免疫球蛋白或其片段，并且可以是天然或者部分或全部合成产生的例如重组分子。抗exosite1抗体分子可以包括包含抗体的抗原结合位点的任意多肽或蛋白，其包括Fab、Fab2、Fab3、双链抗体、三链抗体、四链抗体、微小抗体和单域抗体，包括纳米抗体，以及任意亚型或子类的全抗体。抗体分子及其构建和使用的方法在例如Holliger&Hudson,NatureBiotechnology23(9):1126-1136(2005)中有记载。在一些优选实施方案中，抗exosite1抗体分子可以是全抗体。例如，抗exosite1抗体分子可以是IgG、IgA、IgE或IgM或任意亚型子类，尤其是IgG1和IgG4。抗exosite1抗体分子可以是单克隆抗体。在其他优选实施方案中，抗exosite1抗体分子可以是抗体片段。抗exosite1抗体分子可以是嵌合的、人源化的或人抗体。本文所述的抗exosite1抗体分子可以是分离的，即不含污染物，例如能够结合其本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的抗体分子，其特异性结合凝血酶的exosite 1区，其中，所述抗体分子包含VH区以及VL区，所述VH区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，该HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有序列SEQ ID NO:3、4和5；所述VL区包含LCDR2、LCDR3和LCDR1，该LCDR2和LCDR3分别具有序列SEQ ID NO:8和9，并且该LCDR1具有其中糖基化位点经在对应于序列SEQ ID NO:6中N28的氨基酸残基处引入取代而突变掉的序列SEQ ID NO:7。

【技术特征摘要】
2011.12.14 GB 1121513.41.分离的抗体分子，其特异性结合凝血酶的exosite1区，其中，所述抗体分子包含VH区以及VL区，所述VH区包含HCDR1、HCDR2和HCDR3，该HCDR1、HCDR2和HCDR3分别具有序列SEQIDNO:3、4和5；所述VL区包含LCDR2、LCDR3和LCDR1，该LCDR2和LCDR3分别具有序列SEQIDNO:8和9，并且该LCDR1具有其中糖基化位点经在对应于序列SEQIDNO:6中N28的氨基酸残基处引入取代而突变掉的序列SEQIDNO:7。2.根据权利要求1所述的抗体分子，其抑制凝血酶活性。3.根据权利要求2所述的抗体分子，其对止血造成最低程度的抑制和/或...

【专利技术属性】
技术研发人员：詹姆斯·安德鲁·亨廷顿，特雷弗·巴格兰，乔纳森·兰当，
申请(专利权)人：杨森制药公司，
类型：发明
国别省市：美国,US