稳定的冠状病毒刺突蛋白融合蛋白制造技术

本发明专利技术提供了稳定的重组融合前SARS CoV

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定的冠状病毒刺突蛋白融合蛋白
[0001]本专利技术涉及医学领域。本专利技术特别涉及稳定的重组融合前冠状病毒刺突(S)蛋白，特别是SARS
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CoV
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2 S蛋白，涉及编码所述SARS
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CoV
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2 S蛋白的核酸分子，及这些蛋白和核酸分子例如在疫苗中的用途。

技术介绍

[0002]冠状病毒(CoV)是造成人类轻度呼吸道感染和非典型肺炎的病毒。CoV是属于套式病毒(Nidovirales)目的有包膜的单链正义RNA病毒的大家族，其可以感染广泛的哺乳动物物种，包括猫、狗、牛、蝙蝠和人，以及禽类物种。冠状病毒具有大的三聚体刺突糖蛋白(S)，其介导与宿主细胞受体的结合以及病毒和宿主细胞膜的融合。冠状病毒科包含甲型冠状病毒属(Alphacoronavirus)、乙型冠状病毒属(Betacoronavirus)、丙型冠状病毒属(Gammacoronavirus)和丁型冠状病毒属(Deltacoronavirus)。这些病毒引起一系列疾病，包括肠道和呼吸道疾病。宿主范围主要由病毒刺突蛋白(S蛋白)决定，该蛋白介导病毒进入宿主细胞。可以感染人类的冠状病毒在甲型冠状病毒属和乙型冠状病毒属中均有发现。已知引起人类呼吸道疾病的乙型冠状病毒属的冠状病毒包括SARS
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CoV、MERS
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CoV、HCoV
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OC43和HCoV
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HKU1，以及目前正在传播的SARS
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CoV
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2。
[0003]SARS
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CoV
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2是2019年从动物宿主到人类中出现的冠状病毒，并在全球迅速传播。SARS
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CoV
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2是乙型冠状病毒属，如MERS
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CoV和SARS
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CoV，所有这些病毒均来源于蝙蝠。由该病毒引起的疾病名称是2019冠状病毒病，缩写为COVID
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19。在确诊的COVID
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19病例中，COVID
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19的症状从轻度症状到重度疾病和死亡不等。
[0004]众所周知，病毒通过突变不断发生变化，并且预期新的病毒变体随着时间的推移出现。有时新的变体出现又消失。而其他时候，新的变体出现后会持续存在。在这次全球大流行病期间，全球范围内已经确定了引起COVID
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19的多种病毒变体。科学家们不断监测病毒的变化，包括病毒表面刺突蛋白的变化。CDC与SARS
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CoV
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2跨部门小组(SIG)合作确立了监测中的SARS
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CoV
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2变体的3个分类：值得关注的变体(VOI)、令人担忧的变体(VOC)和引发严重后果的变体(VOHC)。目前确定了几种VOC，包括：
[0005]B.1.1.7：该变体最初在英国检测到。
[0006]B.1.351：该变体最初于2020年12月在南非检测到。
[0007]P.1：该变体最初发现于来自巴西的旅客，这些旅客于1月初在日本机场的例行筛查期间接受检测。
[0008]B.1.427和B.1.429：这两种变体于2021年2月首次发现于加利福尼亚州，并于2021年3月被分类为VOC。
[0009]在美国传播的B.1.526、B.1.526.1、B.1.525、B.1.617、B.1.617.1、B.1.617.2、B.1.617.3和P.2变体被分类为值得关注的变体。
[0010]在美国传播的B.1.1.7、B.1.351、P.1、B.1.427和B.1.429变体被分类为令人担忧的变体。
[0011]在SARS
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CoV
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2的情况下，S蛋白是主要的表面蛋白。S蛋白形成同源三聚体，并由N
末端S1亚基和C末端S2亚基组成，分别负责受体结合和膜融合。最近对甲型冠状病毒属、乙型冠状病毒属和丁型冠状病毒属的CoV三聚体S结构的冷冻电镜(cryo
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EM)重建揭示S1亚基包含两个不同的结构域：N末端结构域(S1 NTD)和受体结合结构域(S1 RBD)。SARS
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CoV
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2利用其S1 RBD与人血管紧张素转换酶2(ACE2)结合(Hoffmann等人(2020)；Wrapp等人(2020))。
[0012]冠状病毒科S蛋白被分类为I类融合蛋白并负责融合。S蛋白通过从不稳定的融合前构象到稳定的融合后构象的不可逆的蛋白质重折叠，将病毒膜和宿主细胞膜融合。与许多其他I类融合蛋白一样，冠状病毒科S蛋白需要受体结合和切割以诱导融合和进入所需的构象变化(Belouzard等人(2009)；Follis等人(2006)；Bosch等人(2008)，Madu等人(2009)；Walls等人(2016))。SARS
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CoV2的启动涉及通过弗林蛋白酶在S1和S2亚基之间的边界(S1/S2)处的弗林蛋白酶切割位点切割S蛋白，和通过TMPRSS2在融合肽上游的保守位点(S2')切割S蛋白(Bestle等人(2020)；Hoffmann等人(2020))。
[0013]为了从融合前构象重折叠到融合后构象，有两个需要重折叠的区域，称为重折叠区1(RR1)和重折叠区2(RR2)(图1)。对于所有I类融合蛋白，RR1包括融合肽(FP)和七肽重复序列1(HR1)。在切割和受体结合后，三聚体中所有三个原体的螺旋、环和链的拉伸转化为长而连续的三聚体螺旋卷曲螺旋。然后，位于RR1的N末端区段的FP能够远离病毒膜延伸并插入到靶细胞的近侧膜中。接着，位于RR1的C末端并更靠近跨膜区(TM)且包括七肽重复序列2(HR2)的重折叠区2(RR2)重新定位到融合蛋白的另一侧，并且将HR1卷曲螺旋三聚体与HR2结构域结合以形成六螺旋束(6HB)。
[0014]当病毒融合蛋白如SARS
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CoV
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2 S蛋白用作疫苗组分时，蛋白质的融合促进功能并不重要。事实上，只有疫苗组分对病毒的模拟对于诱导可结合病毒的反应性抗体才是重要的。因此，为了开发稳健有效的疫苗组分，期望将亚稳态融合蛋白维持为其融合前构象。据信，融合前构象的稳定融合蛋白如SARS
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CoV
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2 S蛋白可诱导有效的免疫应答。
[0015]近年来，已经多次尝试对包括冠状病毒S蛋白在内的各种I类融合蛋白进行稳定处理。证明一种特别成功的方法是在碱基螺旋之前的RR1末端稳定所谓的铰链环(WO2017/037196，Krarup等人(2015)；Rutten等人(2020)，Hastie等人(2017))。该方法也已证明对于冠状病毒S蛋白是成功的，如对于SARS
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CoV、MERS
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CoV和SARS
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CoV2所本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组融合前SARS
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CoV
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2S蛋白或其片段，该蛋白或其片段包含S1和S2结构域，并且包含至少一个突变，该至少一个突变选自由以下组成的组：对应于氨基酸残基941
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945的环区中至少一个氨基酸到P的突变、892位氨基酸的突变、614位氨基酸的突变、572位的突变、532位的突变、残基880与888之间的二硫桥、以及残基884与893之间的二硫桥，其中这些氨基酸位置的编号是根据SEQ ID NO：1中这些氨基酸位置的编号。2.根据权利要求1所述的蛋白或其片段，该蛋白或其片段包含氨基酸序列，其中该892位的氨基酸不是丙氨酸(A)，该614位的氨基酸不是天冬氨酸(D)，该532位的氨基酸不是天冬酰胺(N)和/或该572位的氨基酸不是苏氨酸(T)。3.根据权利要求1或2所述的蛋白或其片段，该蛋白或其片段包含该对应于氨基酸残基941
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945的环区中至少一个氨基酸到P的突变，和选自由以下组成的组的突变：892位氧基酸的突变、61 4位氨基酸的突变、572位的突变、532位的突变、残基880与888之间的二硫桥以及残基884与893之间的二硫桥。4.根据权利要求3所述的蛋白或其片段，该蛋白或其片段包含该对应于氨基酸残基941
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945的环区中至少一个氨基酸到P的突变，和选自由以下组成的组的突变：892位氨基酸的突变、614位氨基酸的突变、572位的突变、532位的突变、残基880与888之间的二硫桥以及残基884与893之间的二硫桥，条件是这些蛋白不同时包含该残基880与888之间的二硫桥和该残基884与893之间的二硫桥。5.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白或其片段，其中该二硫桥是残基880与888之间的二硫桥。6.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白或其片段，其中该对应于氨基酸残基941
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945的环区中至少一个突变是942位的氨基酸突变为P。7.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白或其片段，其中该对应于氨基酸残基941
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945的环区中至少一个突变是941位的氨基酸突变为P。8.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白或其片段，其中该对应于氨基酸残基941
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945的环区中至少一个突变是944位的氨基酸突变为P。9.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白或其片段，其中该892位的突变是突变为P。10.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白或其片段，其中该614位的突变是突变为N或G。11.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白或其片段，其中该532位的突变是突变为P。12.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白或其片段，其中该572位的突变是突变为I。13.根据前述权利要求中任一项所述的蛋白或其片段，该蛋白或其片段包...

【专利技术属性】
技术研发人员：J，
申请(专利权)人：杨森制药公司，
类型：发明
国别省市：