一种鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株及其构建方法和应用，涉及基因工程技术领域，该疫苗株是以鸭瘟疱疹病毒VAC疫苗株的感染性克隆为骨架载体，然后将骨架载体中的毒力基因敲除，得到两种减毒疫苗株，均保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国.武汉.武汉大学，保藏时间为2023年07月05日，保藏编号为CCTCC NO：V202340和CCTCC NO:V202339。本发明专利技术的疫苗株免疫保护率达到100%，本发明专利技术解决了现有疫苗株对非靶动物具有致病性、无法有效预防鸭瘟疱疹病毒强毒株的攻击，以及保护效果不佳的问题。以及保护效果不佳的问题。以及保护效果不佳的问题。

【技术实现步骤摘要】
一种鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]鸭瘟是由鸭瘟疱疹病毒（Duck enteritis virus，DEV）引起的鸭、鹅和其他雁形目禽类的一种急性、热性、败血性传染病，是国际兽医局（OIE）及我国规定的家禽B/二类传染病之一，该病毒主要侵害血管、组织出血、消化道黏膜糜烂、淋巴器官出现病变及实质器官有退行性的病变，感染机体后可广泛分布于全身各组织器官，造成严重的机体损伤，同时具有潜伏感染的特性，使机体长期带毒或不断向外界排毒，导致疾病再次发生。20世纪50年代以来，由于养殖技术落后，饲养数量和饲养密度的不断增加，以及各地区间频繁的活禽调运，导致DEV疫病愈发严重，鸭瘟疱疹病毒在国内相继爆发，流行十分广泛，给水禽业带来巨大的防控挑战。DEV属于疱疹病毒科（Herpesvirales）、α疱疹病毒亚科（Alphaherpesvirinae）、马立克病毒属的成员，与其同属的成员还有马立克氏病毒（MDV）、鸽疱疹病毒（PHV1）以及马疱疹病毒3型（EHV
‑
3）等，DEV基因组为线状双股DNA，长约158kb，由一个长独特区（UL）和一个短独特区（US）以及US两侧的末端倒转重复（TR）与内部重复（IR）组成，细胞浆和细胞核间隙中病毒粒子呈球形，在细胞浆内质网小管系统中成熟病毒粒子直径较大，同时带有囊膜。
[0003]基因缺失减毒疫苗株主要是通过分子生物学的手段，对DEV基因组中毒力基因的若干碱基进行敲除，以达到缺失该基因的目的。DEV具有多个毒力相关基因，分别是UL区的gC、UL2、UL12、UL41、UL47、TK基因和US区的gI、gE、US1、US10基因等，这些基因共同调控DEV的毒力，缺失其中一个或多个基因联合缺失均可导致DEV毒力的减弱。
[0004]近年来，通过建立鸭瘟病毒基因组文库获取大量目的基因核酸序列，进而拼接获得鸭瘟病毒强毒株CHv和弱毒株VAC的全基因组序列，通过克隆至细菌人工染色体获得鸭瘟病毒欧洲强毒株2085的全基因组序列。1965年，中国将鸭瘟自然病毒通过鸭胚传至9代后，在鸡胚绒毛尿膜上连续传至20代，成功培育一弱毒株，命名为C
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KCE，此毒株制成鸭瘟鸡胚化疫苗，该毒株免疫鸭只后安全性高。目前，已有多株鸭瘟病毒完成了基因组测序，如强毒株CHv、鸡胚化弱毒疫苗株C
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KCE及分离弱毒疫苗株VAC等。鸭瘟疱疹病毒减毒株作为基因工程载体具备相当的优势：（1）减毒株对非靶动物不具有致病性，安全性很好；（2）基因组容量大：在DEV长达160 Kb的基因组中，含有多个非必需基因（如gI、gE、US5、TK、UL2和dUTPase等），在这些区域内可先后或同时插入和表达多种外源基因，而不显著影响其繁殖及免疫原性；（3）生产原材料来源方便，生产成本低：DEV疫苗可以接种SPF鸭胚成纤维细胞及BHK
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21等传代细胞生产，原材料充足，生产工艺成熟，且DEV病毒滴度很容易达到免疫要求，大大降低了生产成本；（4）宿主范围广，各种类型的水禽、家禽等均可感染DEV，可研制针对不同动物的活载体疫苗。然而，现有的疫苗株存在对非靶动物具有致病性、无法有效预防鸭瘟疱疹病毒强毒株的攻击和保护效果不佳等缺陷，因此，迫切需要一种新的鸭瘟疱疹病毒基因缺
失减毒疫苗株。

技术实现思路

[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株及其构建方法和应用，以解决现有疫苗株对非靶动物具有致病性、无法有效预防鸭瘟疱疹病毒强毒株的攻击以及保护效果不佳的问题。
[0006]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株，该疫苗株是以鸭瘟疱疹病毒VAC疫苗株的感染性克隆为骨架载体，然后将骨架载体中的毒力基因敲除，形成鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株。
[0007]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进：进一步，该疫苗株是以鸭瘟疱疹病毒VAC疫苗株基因组，通过核酸外切酶联合Red/ET同源重组，直接克隆到大肠杆菌中的细菌人工染色体中，然后将骨架载体中毒力基因敲除，得到鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株。
[0008]进一步，毒力基因为gI基因、gE基因、TK基因、gG基因和gJ基因。
[0009]进一步，毒力基因为gI基因、gE基因、TK基因和UL4基因。
[0010]进一步，gI基因缺失1
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689位碱基，gE基因缺失544
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754位碱基，TK基因缺失457
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1017位碱基，gG基因缺失1145
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1380位碱基，gJ基因缺失445
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1183位碱基。进一步，gI基因缺失1
‑
689位碱基，gE基因缺失544
‑
754位碱基，TK基因缺失457
‑
1017位碱基，UL4基因缺失1
‑
435位碱基。
[0011]进一步，gGgJ敲除后序列如SEQ ID No：1所示。
[0012]进一步，gIgE敲除后序列如SEQ ID No：2所示。
[0013]进一步，TK敲除后序列如SEQ ID No：3所示。
[0014]进一步，UL4敲除后序列如SEQ ID No：4所示。
[0015]进一步，敲除五个毒力基因得到的鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株为DEV VAC/ΔgIgE
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ΔTK
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ΔgGgJ株，命名为鸭瘟疱疹病毒减毒疫苗株9C2。
[0016]进一步，鸭瘟疱疹病毒减毒疫苗株9C2现已于2023年07月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO： V202340，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
[0017]进一步，敲除四个毒力基因得到的鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株为DEV VAC/ΔgIgE
‑
ΔTK
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ΔUL4株，命名为鸭瘟疱疹病毒减毒疫苗株9D1。
[0018]进一步，鸭瘟疱疹病毒减毒疫苗株9D1现已于2023年07月05日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO： V202339，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。
[0019]本专利技术还提供上述鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株的构建方法，包括以下步骤：（1）BR322
‑
amp
‑
HA
‑
BAC
‑
RHA
‑
gpt构建及筛选：高保真PCR制备DNA片段BR322
‑
amp、同源臂LHA和RHA
‑
gpt以及BAC，按照ExoCET方法所描述的方案用T4聚合酶孵育，将DNA混合物电孔插入大肠杆菌GB05
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株，其特征在于，该疫苗株是以鸭瘟疱疹病毒VAC疫苗株的感染性克隆为骨架载体，然后将骨架载体中的毒力基因敲除，得到鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株；所述毒力基因为gI基因、gE基因、TK基因、gG基因和gJ基因；或所述毒力基因为gI基因、gE基因、TK基因和UL4基因；所述毒力基因为gI基因、gE基因、TK基因、gG基因和gJ基因时，gI基因缺失1
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689位碱基，gE基因缺失544
‑
754位碱基，TK基因缺失457
‑
1017位碱基，gG基因缺失1145
‑
1380位碱基，gJ基因缺失445
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1183位碱基；所述毒力基因为gI基因、gE基因、TK基因和UL4基因时，gI基因缺失1
‑
689位碱基，gE基因缺失544
‑
754位碱基，TK基因缺失457
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1017位碱基，UL4基因缺失1
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435位碱基。2.权利要求1所述的鸭瘟疱疹病毒基因缺失减毒疫苗株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）BR322
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amp
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HA
‑
BAC
‑
RHA
‑
gpt构建及筛选：高保真PCR制备DNA片段BR322
‑
amp、同源臂LHA和RHA
‑
gpt以及BAC，按照ExoCET方法所描述的方案用T4聚合酶孵育，将DNA混合物电孔插入大肠杆菌GB05
‑
dir中，在含有氨苄青霉素抗性的LB板上筛选BR322
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amp
‑
HA
‑
BAC
‑
RHA
‑
gpt；（2）鸭瘟疱疹病毒的接种：将鸭瘟疱疹病毒VAC疫苗株接种到原代鸭胚成纤维细胞中，得到染毒DEF细胞；（3）重组病毒的拯救：使用BAC质粒提取试剂盒，从步骤（1）构建的BR322
‑
amp
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HA
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BAC
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RHA
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gpt中提取基因组DNA，使用脂质体转染试剂盒，将基因组DNA转染到步骤（2）制得的染毒DEF细胞中，以拯救病...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢青梅，孔洁，符军，宋超逸，封柯宇，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：