改进的人视网膜色素（RPE）细胞和感光祖细胞的效能测定制造技术

本公开提供新的吞噬测定来测试RPE细胞和感光祖细胞的功能，该测定使用对pH敏感的荧光标记。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】改进的人视网膜色素(RPE)细胞和感光祖细胞的效能测定相关申请本申请要求按照35U.S.C.§119(e)于2015年3月23日递交的题为“改进的人视网膜色素细胞和感光祖细胞的效能测定”的美国临时申请系列号62/136,660的权益，其全部内容通过引用并入本文。专利
本专利技术涉及基于细胞的体外方法用于测量感光视杆细胞外节的吞噬的用途。背景视网膜色素上皮细胞(RPE)是下面的脉络膜(视网膜后面的血管层)和上面的视网膜视觉细胞(例如感光细胞——视杆细胞和视锥细胞)之间的感觉神经视网膜外的色素化细胞层。RPE对于感光细胞和视网膜的功能和健康至关重要。RPE通过回收感光色素，传递、代谢和储存维生素A，吞噬感光视杆细胞外节，在视网膜和脉络膜之间运输铁和小分子，维持布鲁赫膜和吸收杂散光以允许更好的图像分辨率来保持感光细胞功能。参见例如WO2009/051671；EngelmannandValtink(2004)“RPECellCultivation.”Graefe’sArchiveforClinicalandExperimentalOphthalmology242(1):65–67；IrinaKlimanskaya,RetinalPigmentEpitheliumDerivedFromEmbryonicStemCells,于StemCellAnthology335–346(BruceCarlsoned.,2009)。RPE变性能够导致视网膜脱离，视网膜不典型增生或视网膜萎缩，这与导致感光细胞损伤和失明的许多改变视力的疾病有关，如脉络膜血症，糖尿病性视网膜病，黄斑变性(包括年龄相关性黄斑变性，AMD)和眼底黄斑营养不良(Stargardt’smaculardystrophy，SMD)，后两者分别是世界上成人和青少年失明的两个主要原因。虽然两者目前无法治疗，但在黄斑变性的临床前模型中有证据表明移植hESC衍生的RPE可挽救感光细胞并阻止视力丧失(LundRD,WangS,KlimanskayaI,etal.Humanembryonicstemcell-derivedcellsrescuevisualfunctionindystrophicrats.CloningandStemCells2006；8,189-199；LuB,MalcuitC,WangS,etal.Long-termsafetyandfunctionofRPEfromhumanembryonicstemcellsinpreclinicalmodelsofmaculardegeneration.StemCells2009；21,2125-2135)。还促进上述一些疾病是有丝分裂后神经元细胞的额外损失。这些视网膜疾病包括视杆细胞或视锥细胞营养不良，视网膜变性，视网膜色素变性(RP)，糖尿病性视网膜病变，黄斑变性，莱伯先天性黑内障和眼底黄斑症(Stargardtdisease)。在大多数视网膜变性的病例中，细胞丢失主要在包括视杆细胞和视锥细胞感光细胞的外核层(ONL)中。感光细胞的潜在替代来源包括干细胞。早期研究评估了小鼠细胞，小鼠干细胞或异质视网膜祖细胞群作为失去感光细胞的替代细胞的可能来源。这些早期研究描述了从出生后第1天的小鼠视网膜移植感光祖细胞(Maclarenetal.Nature444(9):203-207,2006)，从小鼠胚胎干细胞体外产生视网膜祖细胞(Ikedaetal.Proc.Natl.Acad.Sci.102(32):11331-11336,2005)，从出生后第1天的小鼠视网膜产生视网膜祖细胞(Klassenetal.Invest.Ophthal.Vis.Sci.45(11):4167-4175,2004)，将骨髓间充质干细胞植入视网膜变性的RCS大鼠模型(Inoueetal.Exp.EyeRes.8(2):234-241,2007)，从H1人胚胎干细胞系产生视网膜祖细胞，包括神经节细胞，无长突细胞，其中总细胞的0.01％表达S-视蛋白或视紫红质的感光细胞，双极细胞和水平细胞(Lambaetal.Proc.Natl.Acad.Sci.10(34):12769-12774,2006)，并且从人成纤维细胞诱导诱导性多能干细胞(iPS)以产生视网膜祖细胞(Lambaetal.PLoSONE5(1):e8763.doi:10.1371/journal.pone.0008763)。这些方法都没有产生用于植入的均质感光祖细胞或感光细胞群。这些方法都没有产生显示出体内视杆细胞或视锥细胞功能(例如，通过赋予视敏度改善能够检测)的均质感光祖细胞或感光细胞群。感光细胞和感光祖细胞可能从其中分离的供体衍生组织(例如尸体、胎儿组织和活体动物)的供应受到限制。干细胞可以体外无限增殖和扩增，为人治疗提供了非供体来源细胞的潜在来源。将干细胞分化成均质感光祖细胞或感光细胞群可以提供用于植入和治疗视网膜疾病的非供体衍生细胞的大量供应。感光祖细胞可具有吞噬活性。在共同拥有的2010年11月17日提交的美国专利申请序列号13/510,426和PCTUS2012/65091中公开了某些主题，包括制备RPE细胞的方法，RPE细胞的组合物，以及针对RPE细胞的释放测定(包括吞噬测定)，这样的教导通过引用结合于此。共同拥有的PCTUS2014/029790中公开了某些主题，包括制造感光祖细胞的方法，以及感光祖细胞的组合物和测试功能的方法(包括吞噬测定)，这样的教导通过引用结合于此。概述已经使用FITC标记的感光细胞外节(OS)(通常是牛或猪)来研究视网膜色素上皮(RPE)在体外的吞噬。然而，用于吞噬评估的大多数定量方法(FACS，荧光酶标仪)不区分表面结合的和内化的颗粒，因此不能专门解释涉及表面受体结合和内化吞噬阶段的机制。此外，FITC荧光对pH敏感，并且FITC荧光在pH低于6时显著降低，而溶酶体和与溶酶体融合的吞噬体的pH低于5。因此，FITC标记的OS的荧光可能不能真正代表内化OS的量。本文提供了用于检测感光细胞外节的内化吞噬的更灵敏和准确的测定，这是RPE细胞和感光祖细胞功能的重要量度，因此是用于治疗视网膜疾病的RPE细胞和感光祖细胞的重要发布标准，视网膜疾病如视锥细胞或视杆细胞营养不良，视网膜变性，视网膜色素变性，脉络膜血症，糖尿病性视网膜病，黄斑变性(包括年龄相关性黄斑变性和近视性黄斑变性)，莱伯先天性黑内障和眼底黄斑症(fundusflavimaculatus)。参见例如WO2009/051671。本文所述的RPE细胞在移植后起作用。为此，RPE细胞在接受移植细胞的受试者(或患者)中的感觉神经视网膜和脉络膜之间形成单层。RPE细胞还可以向邻近的感光细胞提供营养，并通过吞噬处理脱落的感光细胞外节。可以基于许多功能和/或表型特征(包括但不限于吞噬活性)来选择适于移植的RPE细胞。例如，可根据其吞噬活性以及其增殖效能评估适于移植的RPE细胞。例如，RPE细胞可具有比来自眼供体的细胞更大的增殖效能(例如，RPE细胞比眼供体的“年轻”)。这使得本文描述的RPE细胞比来自眼供体的细胞具有更长的有用寿命。RPE细胞效能在临床背景中的一个关键参数是RPE细胞药物制本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于评估吞噬活性的方法，包括：将细胞与感光细胞外节(POS)孵育足以使细胞吞噬POS的时间和温度，其中POS在酸性pH下比在更高pH下发出更强的荧光，检测孵育后细胞的荧光强度，其中与对照相比荧光增加指示细胞对POS的吞噬。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.23 US 62/136,6601.用于评估吞噬活性的方法，包括：将细胞与感光细胞外节(POS)孵育足以使细胞吞噬POS的时间和温度，其中POS在酸性pH下比在更高pH下发出更强的荧光，检测孵育后细胞的荧光强度，其中与对照相比荧光增加指示细胞对POS的吞噬。2.权利要求1的方法，其中细胞与POS在约室温至约37℃或约室温至约40℃的温度范围下孵育。3.权利要求1的方法，其中细胞与POS在约室温、约生理温度或约37℃下孵育。4.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞与POS孵育约16-20小时。5.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞作为细胞培养物提供。6.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞是汇合的细胞培养物。7.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞是RPE细胞。8.前述权利要求中任一项的方法，其中细胞是人RPE细胞。9.权利要求1-6中任一项的方法，其中细胞是感光祖细胞。10.权利要求1-6中任一项的方法，其中细胞是人感光祖细胞。11.前述权利要求中任一项的方法，其中POS用Red染料标记。12.前述权利要求中任一项的方法，其中对照是与POS在低于室温下孵育的细胞。13.前述权利要求中任一项的方法，其中对照是与POS在4℃下孵育的细胞。14.前述权利要求中任一项的方法，其中通过流式细胞术检测荧光。15.前述权利要求中任一项的方法，其中使用酶标仪检测荧光。16.用于评估吞噬活性的方法，包括：提供用荧光标记标记的感光细胞外节(POS)，当通过吞噬内化进入细胞的低pH隔室时，荧光标记相对于当荧光标记细胞外存在时的荧光信号具有改变的荧光信号；将测试细胞与标记的POS在允许吞噬标记的POS的条件下孵育；和检测与标记的POS孵育后测试细胞中改变的荧光(如果有的话)，并由此定量测试细胞的吞噬活性。17.权利要求16的方法，其中改变的荧光信号是荧光信号相对于当荧光标记细胞外存在时的强度增加。18.权利要求16或17的方法，其中通过流式细胞术能够检测改变的荧光信号。19.权利要求16-18中任一项的方法，其中改变的荧光信号将通过吞噬内化的标记的POS和结合在测试细胞表面但未内化的标记的POS区分开。20.权利要求16-18中任一项的方法，其中将在测试细胞中检测到的改变的荧光信号与用标记的POS孵育的对照细胞群进行比较以定量测试细胞的吞噬活性。21.权利要求20的方法，其中对照细胞群与标记的POS在低于室温下孵育。22.权利要求16-21中任一项的方法，其中测试细胞包含视网膜色素上皮(RPE)细胞。23.权利要求16-21中任一项的方法，其中测试细胞包含感光祖细胞。24.权利要求22或23的方法，其中测试细胞是人细胞。25.权利要求16-24中任一项的方法，其中测试细胞是通过多能干细胞的体外分化产生的。26.权利要求16-24中任一项的方法，其中测试细胞是冷冻保藏并在使用之前解冻的。27.权利要求16-24中任一项的方法，其中荧光标记是Red。28.权利要求16-24中任一项的方法，其中POS用Red和RedE.coliBioParticles标记。29.用于评估测试细胞群中的吞噬活性的标记的感光细胞外节(POS)制剂，POS用荧光标记标记，当通过吞噬内化进入细胞的低pH隔室时，荧光标记相对于当荧光标记细胞外存在时的荧光信号具有改变的荧光信号。30.权利要求29的制剂，其中改变的荧光信号是荧光信号相对于当荧光标记细胞外存在时的强度增加。31.权利要求29或30的制剂，其中通过流式细胞术能够检测改变的荧光信号。32.权利要求29-31中任一项的制剂，其中荧光标记是Red。33.权利要求29-31中任一项的制剂，其中POS用Red和RedE.coliBioParticles标记。34.用于测量细胞群中的吞噬活性的方法，包括测量与非FITC荧光标记的感光细胞外节(POS)接触的测试细胞群中的测试荧光，将测量的测试荧光与对照荧光进行比较，其中非FITC荧光标记的POS在酸性pH下发荧光但在较高pH下不发荧光或发出最低限度的荧光。35.权利要求34的方法，其中测试细胞群与非FITC荧光标记的POS在约室温至约生理温度或约室温至约40℃的温度范围下接触。36.权利要求34的方法，其中对照荧光是与非FITC荧光标记的POS在低于室温下接触的细胞群的荧光。37.权利要求34的方法，其中测试细胞群与非FITC荧光标记的POS在约15至40℃的温度下或在约生理温度下接触。38.权利要求34-37中任一项的方法，其中对照荧光是与非FITC荧光标记的POS在4℃下接触的细胞群的荧光。39.用于测量吞噬活性的方法，包括：(1)测量与用Red染料标记的荧光标记的感光细胞外节(POS)在约室温至约生理温度或约室温至约40℃的温度范围下孵育的细胞群的第一等分试样中的测试荧光，和(2)测量与用Red染料标记的荧光标记的POS在低于室温下孵育的细胞群的第二等分试样中的对照荧光，其中比对照荧光更强的测试荧光指示细胞群的吞噬活性。40.权利要求39的方法，其中细胞群是RPE细胞群。41.权利要求39的方法，其中细胞群是感光祖细胞群。42.用于测量吞噬活性的方法，包括：(1)测量与仅用Red标记的感光细胞外节(POS)或用Red和RedE.coliBioParticles标记的感光细胞外节(POS...

【专利技术属性】
技术研发人员：I·V·克利曼斯卡亚，J·K·卡森，R·盖伊，Y·G·伊万诺娃，
申请(专利权)人：安斯泰来再生医药协会，
类型：发明
国别省市：美国,US