苏云金芽孢杆菌(BACILLUS THURINGIENSIS)的杀虫蛋白制造技术

本发明专利技术涉及来自苏云金芽孢杆菌菌株的新杀虫化合物。本发明专利技术提供了被命名为ＣｒｙｌＪｄ、Ｃｒｙ９Ｆａ、和ＣｒｙｌＢｆ的新蛋白及其杀虫片断，以及编码这些蛋白或其杀虫片断的ＤＮＡ序列。本发明专利技术进一步提供了表达这些蛋白的重组宿主，尤其是植物细胞和植株。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
引言本专利技术涉及编码苏云金芽孢杆菌产生的杀虫蛋白的新的DNA序列。具体地说，本专利技术提供了编码被命名为Cry9Fa、Cry1Jd和Cry1Bf的蛋白的新的DNA序列，其有益于保护植物免受昆虫侵害。此处也包括用至少一种该新分离基因转化的微生物和植物，这样它们通过表达杀虫蛋白而赋予昆虫抗性。
技术介绍
(i)专利
Bt或苏云金芽孢杆菌因其对昆虫害虫的特异毒性而广为所知，并被用于控制植物的昆虫害虫几乎达一个世纪之久。最近几年，已经有了表达Bt蛋白的转基因植物，其已被发现能成功控制昆虫对植物的损害(如Vaeck等，1987)。尽管许多Bt晶体蛋白基因已经得到分离，但是对于编码杀虫蛋白的新基因的搜索仍在继续。实际上，与化学杀虫剂相比，Bt杀虫晶体蛋白的靶标昆虫范围公知为相对较窄。而且，对相同靶标昆虫种类具有多重毒性活性使得可使用具有不同作用方式的蛋白成为可能，从而可以防止或延缓昆虫抗性的发展。(ii)相关技术描述先前，Cry1B-、Cry1J-和Cry9蛋白的几种类型已得到鉴定(见Crickmore等，1998，全部详情并入此文以作参考)。新的Cry1Bf蛋白与Cry1Be蛋白的序列同源性最为接近(Payne等，1998，美国专利5,723,758)，但前者毒性蛋白片断的氨基酸序列与Cry1Be蛋白毒性片断的氨基酸序列相比，仍有约14％的差异。与Cry1Jd的毒性片断序列同源性最接近的为Cry1Jc1蛋白的毒性片断(美国专利5,723,758)，但这两个蛋白毒性片断的氨基酸序列仍有约18％的差异。如Midoh等人(PCT专利公开WO 98/26073)和Narva等人(PCT专利公开WO 98/00546)所述，与Cry9Fa的毒性片断序列同源性最接近的为Cry9Ea1蛋白的毒性片断，但Cry9Fa和Cry9Ea蛋白的毒性片断仍有约21％的氨基酸序列差异。本专利技术特别优选编码含有下列氨基酸序列的蛋白的DNA序列SEQ IDNo.2蛋白的杀虫片断的氨基酸序列、SEQ ID No.4蛋白的杀虫片断的氨基酸序列和SEQ ID No.6蛋白的杀虫片断的氨基酸序列；或者可选编码含有下列氨基酸序列的蛋白的DNA序列SEQ ID No.2的氨基酸序列、SEQ IDNo.4的氨基酸序列、SEQ ID No.6的氨基酸序列；或者含有SEQ ID No.1、SEQ ID No.3、或SEQ ID No.5 DNA序列的DNA序列。此外，本专利技术提供了这样的DNA序列，其至少编码新分离蛋白的下列部分SEQ ID No.2从第1位氨基酸到第640位氨基酸的氨基酸序列、SEQID No.4从第1位氨基酸到第596位氨基酸的氨基酸序列、SEQ ID No.6从第1位氨基酸到第652位氨基酸的氨基酸序列。此外，本专利技术提供了含有人工DNA序列的上述DNA序列，该人工DNA序列具有不同于天然存在的DNA序列中的密码子使用，但却编码相同的蛋白或其杀虫片断。更进一步地，本专利技术提供了包含选自下列氨基酸序列的蛋白a)由保藏在BCCM-LMBP，保藏号为LMBP 3986的cry1Bf基因所编码蛋白的杀虫的胰蛋白酶消化片断的氨基酸序列，b)由保藏在BCCM-LMBP，保藏号为LMBP3983的cry1Jd基因所编码蛋白的杀虫的胰蛋白酶消化片断的氨基酸序列，c)由保藏在BCCM-LMBP，保藏号为LMBP 3984的cry9Fa基因所编码蛋白的杀虫的胰蛋白酶消化片断的氨基酸序列。此处尤其优选包含选自下列氨基酸序列的蛋白SEQ ID No.2蛋白的杀虫片断的氨基酸序列、SEQ ID No.4蛋白的杀虫片断的氨基酸序列和SEQID No.6蛋白的杀虫片断的氨基酸序列；或者包含选自下列氨基酸序列的蛋白SEQ ID No.2从第1位氨基酸到第640位氨基酸的氨基酸序列、SEQID No.4从第1位氨基酸到第596位氨基酸的氨基酸序列、SEQ ID No.6从第1位氨基酸到第652位氨基酸的氨基酸序列；或者含有SEQ ID No.2、SEQ ID No.4、或SEQ ID No.6氨基酸序列的蛋白。此处，本专利技术也提供了含有在植物表达启动子控制下的上述DNA的嵌合基因和由转化而含有那些嵌合基因的植物细胞、植株或种子，其中所述植物细胞、植株或种子尤其选自玉米、棉花、水稻、油菜籽、芸苔、茄子、大豆、土豆、向日葵、西红柿、甘蔗、茶叶、豌豆、烟草、草莓、苜蓿、黄瓜、西瓜、胡椒、燕麦、大麦、小麦、天竺牡丹、剑兰、菊花、甜菜、高粱、紫花苜蓿和花生。按本专利技术所述，该嵌合基因整合入植物细胞的染色体DNA或叶绿体DNA。另外，本专利技术也提供了由转化而含有任何上述DNA序列的、尤其是选自土壤杆菌属(Agrobacterium)、埃希氏菌属(Escherichia)或芽孢杆菌属(Bacillus)的微生物。此处也提供了一种控制昆虫的方法和使植物抗昆虫的方法，其中所述控制昆虫的方法包括在宿主细胞、尤其是植物细胞中表达任何上述DNA序列，并使昆虫和所述宿主细胞相接触；其中所述使植物抗昆虫的方法包括用任何上述DNA序列或嵌合基因转化植物细胞，并从此类抗昆虫细胞再生出转化植株。按本专利技术所述，“Cry1Bf蛋白”指含有SEQ ID No.2氨基酸序列的、保留杀虫活性的最小蛋白片断的任何蛋白，尤其是含有SEQ ID No.2中第1位氨基酸到第640位氨基酸的氨基酸序列的任何蛋白，包括但不限于具有SEQ ID No.2氨基酸序列的完整蛋白。这包括含有该最小毒性蛋白片断的杂合或嵌合蛋白，也包括至少含有SEQ ID No.2毒性片断三个功能结构域中之一的蛋白。此处所用术语“含有序列X的DNA/蛋白”是指至少包括或含有此序列X的DNA或蛋白，从而在5’(或N-末端)和/或3’(或C-末端)末端可包括其它核苷酸或氨基酸序列，如EP 0 193 259公开的可选择性标记蛋白(的核苷酸序列)。按本专利技术所述，“Cry9Fa蛋白”或“Cry9F蛋白”是指含有SEQ ID No.6氨基酸序列的、保留杀虫活性的最小蛋白片断的任何蛋白，尤其是含有SEQ ID No.6中第1位氨基酸到第652位氨基酸的氨基酸序列的任何蛋白，包括但不限于具有SEQ ID No.6氨基酸序列的完整蛋白。这包括含有该最小毒性蛋白片断的杂合或嵌合蛋白，也包括至少含有SEQ ID No.6毒性片断三个功能结构域中一个的蛋白。按本专利技术所述，“Cry1Jd蛋白”是指含有SEQ ID No.4氨基酸序列的、保留杀虫活性的最小蛋白片断的任何蛋白，尤其是含有SEQ ID No.4中第1位氨基酸到第596位氨基酸的氨基酸序列的任何蛋白，包括但不限于具有SEQ ID No.4氨基酸序列的完整蛋白。这包括含有该最小毒性蛋白片断的杂合或嵌合蛋白，也包括至少含有SEQ ID No.4毒性片断三个功能结构域中一个的蛋白。此处所用术语“cry1Bf DNA”、“cry9Fa DNA”或“cry1Jd DNA”分别是指编码如上所述的Cry1Bf、Cry9Fa或Cry1Jd蛋白的任何DNA序列。这包括编码如上所述的新分离蛋白或其杀虫片断的天然存在的、人工的或合成的DNA序列。此处也包括与所保藏的基因组DNA序列或序列列表中所提供序列的编码区足够相似的、编码杀虫蛋白的DNA序列本文档来自技高网...

【技术保护点】
编码蛋白的ＤＮＡ，其中蛋白含有下列氨基酸序列：ａ）由保藏于ＢＣＣＭ－ＬＭＢＰ，保藏号为ＬＭＢＰ ３９８６的ｃｒｙ１Ｂｆ基因所编码蛋白的杀虫的胰蛋白酶消化片断的氨基酸序列，ｂ）由保藏于ＢＣＣＭ－ＬＭＢＰ，保藏号为ＬＭＢＰ ３９８３的ｃｒｙ１Ｊｄ基因所编码蛋白的杀虫的胰蛋白酶消化片断的氨基酸序列，和ｃ）由保藏于ＢＣＣＭ－ＬＭＢＰ，保藏号为ＬＭＢＰ ３９８４的ｃｒｙ９Ｆａ基因所编码蛋白的杀虫的胰蛋白酶消化片断的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：G阿尔诺，A伯特斯，N达默，E马蒂厄，S万内斯特，J万瑞，
申请(专利权)人：拜尔作物科学公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]