新的苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白质制造技术

本发明专利技术涉及植物害虫控制领域，特别是昆虫控制。提供了来源于苏云金芽孢杆菌的、编码杀昆虫蛋白质的核苷酸序列。进一步提供了利用所述核苷酸序列控制植物昆虫害虫的方法和手段。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物害虫控制，特别是昆虫控制领域。提供了来源于苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)(Bt)菌株的新的核酸序列，其编码营养生长阶段表达的杀昆虫蛋白质。具体地，提供了编码命名为ISP3-1099E，ISP3-327D和ISP3-2245J的蛋白质的DNA序列，其可用于保护植物免受昆虫损害。进一步提供了包含至少一个新的核酸分子的植物和微生物，及利用这些核酸序列降低植物受到的昆虫损害的方法和手段。
技术介绍
昆虫害虫使全世界农作物生产遭受着巨大经济损失，并且农民每年都面临由于虫害造成的产量损失威胁。农作物中的昆虫抗性基因工程已经成为降低农作物管理和化学控制实践的相关花费的具有吸引力的方法。基于在植物中表达从革兰氏阳性土壤细菌苏云金芽孢杆菌(Bt)分离的蛋白质，自1996年以来，第一代昆虫抗性农作物已经投放市场。该杀昆虫Bt Cry蛋白质在Bt菌株的孢子形成阶段产生，并且该蛋白质在细菌中以大的胞质晶体积累。当被昆虫摄取时，典型的鳞翅目(Lepidopteran)毒性Bt Cry蛋白质在昆虫中肠中溶解和加工成为约60到65kDa的活性形式。此活性蛋白质通过结合中肠上皮细胞发挥它的毒性作用，在细胞膜中引起穿孔，这引起细胞渗透裂解。Bt菌株可以产生许多不同的毒素。自从1981年第一个编码杀昆虫晶体蛋白质的Bt基因分离以来(Schnepf和Whiteley 1981)，已经克隆了100多种Bt Cry毒素编码基因，并且通过在农业重要作物物种中表达Bt来源的蛋白质已经有效地控制了昆虫害虫。然而，因为大多数Bt蛋白质主要仅仅对相对小数量的现存昆虫害虫有活性，所以单独Bt蛋白质的应用常常是有限的。据认为，多种因素诸如昆虫肠道中毒素的激活(Haider等，1996)和其结合特异性受体的能力(Hofmann等，1988)决定Bt Cry蛋白质的特异性。现普遍认识到存在敏感昆虫物种可能发展出对Bt Cry毒性的抗性的风险。因此，已经进行了积极的努力以鉴定新的杀昆虫蛋白质。曾经采用的一个策略是在营养生长阶段，而不是在孢子形成阶段筛选产生杀昆虫蛋白质的芽孢杆菌属(Bacillus)菌株。利用这个方法，已经鉴定了大量“营养期杀昆虫蛋白质”或“VIP”。Estruch等(1996)、WO94/21795、WO96/10083、WO98/44137、US5,877,012、US 6,107,279、US 6,137,033和US 6,291,156描述了从Bt菌株AB88、AB424和AB51上清液中分离vip3A(a)，vip3A(b)和vip3A(c)。根据作者所述，这些基因编码具有针对广谱鳞翅目(Lepidopteran)昆虫害虫的杀昆虫活性的蛋白质。WO98/18932和WO99/57282描述了从Bt菌株分离的大量核苷酸序列。这些序列称为mis(mis-1到mis-8)，war和sup。根据作者所述，编码的蛋白质具有抗鳞翅目(Lepidopteran)或鞘翅目(Coleopteran)害虫的活性。WO00/09697描述了可从侧孢芽孢杆菌(Bacillus Laterosporus)菌株获得的热不稳定性可溶MIS型和WAR型毒素，以及较小的(1到10kDa)毒素，根据作者所述，这些毒素具有抗玉米根叶甲幼虫的活性。WO98/00546和US6,274,721描述了Bt菌株和Bt毒素的分离，根据作者所述，其具有抗鳞翅目(Lepidopteran)害虫的活性。WO99/33991描述了Bt菌株和Bt毒素的分离，根据作者所述，其具有抗鳞翅目(Lepidopteran)害虫的活性。最近，Selvapandiyan等(2001)描述了编码命名为VIP-S的蛋白质的基因的分离。根据作者所述，VIP-S蛋白质显示了抗多种鳞翅目(Lepidopteran)昆虫物种的毒性。Doss等(2002)描述了来源于菌株Bt kurstaki的VIP3V的克隆。WO02/078437描述了来源于Bt的VIP3毒素，诸如VIP3A，VIP3B和VIP3A-B杂交毒素。尽管到目前为止，已经分离和表征了相对大量的不同杀昆虫蛋白质，但是还需要鉴定、分离和表征新的杀昆虫蛋白质。该原因是多方面的。首先，由于杀昆虫蛋白质对特定靶害虫群体(宿主昆虫谱)的特异性，因此需要克隆编码具有不同活性谱的蛋白质的基因，以便对于不同的农作物和不同的地理区域，可得到与昆虫害虫作斗争的合适蛋白质。例如，Bt Cry蛋白质的特异性大多是受限制的。仍期望鉴定具有针对不同靶昆虫的特异性的毒素。其次，在一个地理区域长期使用后，已知昆虫有能力发展出对化学杀虫剂、微生物喷雾剂(例如，基于Bt孢子-晶体混合物)的抗性，并且认为昆虫有能力发展出对表达杀昆虫蛋白质的植物的抗性。昆虫种群中抗性的发展可能潜在地使现有的杀昆虫蛋白质失效，这就提供了对于新的基因和蛋白质的需要。第三，因为健康和环境原因，可能期望鉴定具有高度且特异的杀昆虫效力和对靶昆虫物种的急性生物活性的蛋白质。此后，包括权利要求书中描述的不同实施方式，描述了从苏云金芽孢杆菌菌株分离的新的核酸序列和氨基酸序列，通过在合适启动子控制下于植物中表达此核酸序列，或者通过给植物外部施用毒素，其可用于保护植物免受昆虫损害。本专利技术毒素不同于先前描述的杀虫毒素。专利技术概述本专利技术提供了杀昆虫ISP3蛋白质和编码它们的核酸。提供了杀昆虫蛋白质ISP3-1099E(SEQ ID No.2)，ISP3-327D(SEQ ID No.4)和ISP3-2245J(SEQ ID No.6)和分别编码它们的核酸isp3-1099E(SEQ ID No.1)，isp3-327D(SEQ ID No.3)和isp3-2245J(SEQ ID No.5)。本专利技术蛋白质具有抗鳞翅目昆虫害虫的杀昆虫活性，特别是抗选自美洲棉铃虫(Helicoverpazea)，棉铃虫(Helicoverpa Armigera)，Helicoverpa punctigera，烟芽夜蛾(Heliothis vireseens)，欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)，草地粘虫(Spodoptera frugiperda)，小地老虎(Agrotis ipsilon)，棉花红铃虫(Pectinophora gossypiella)，三化螟(Scirpophaga incertulas)，稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis)，大螟(Sesamia inferens)，Chilo partellus，藜豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)，苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra)，大豆夜蛾(Pseudoplusia includens)，甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)，Spodoptera ornithogalli，Epinotia aporema和Rachiplusia nu.的昆虫。在本专利技术另一个实施方式中，提供了ISP3蛋白质和编码它们的核酸的杀昆虫变异体和片段。提供的变异体是例如在严格条件下与SEQ ID No.1，SEQ ID No.3或SEQ ID No.5杂交的核酸序列。在本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含与ＳＥＱＩＤＮｏ．４具有至少９１％序列同一性的氨基酸序列的分离的杀昆虫蛋白质。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：G阿尔诺，A伯特斯，K德鲁德尔，S万内斯特，J范瑞，
申请(专利权)人：拜尔生物科学公司，
类型：发明
国别省市：BE[比利时]