人胚胎干细胞系建立的方法技术

本发明专利技术涉及一种人胚胎干细胞建系方法。用机械的方法去除囊胚的透明带，然后将内细胞团切割成２～３块进行培养；制备饲养层时，将射线或丝裂霉素处理后的成纤维细胞直接使用；１～４代传代培养时挑取单个克隆，将克隆分割成无数小块后进行培养，而５代以后细胞克隆较多时用胶原酶消化传代。本发明专利技术的优点在于方法简便，重复性好，成功率高，细胞生长快速，增殖活跃，建系时间缩短。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人胚胎干细胞建系方法。人胚胎干细胞(embryonic stem cell，ES)是从早期胚胎细胞分离出来的、能在体外长期培养且高度未分化的细胞，具有向机体各种组织细胞分化的潜能。由于ES细胞的全能性，为研究机体各系统的发育分化的调控机制及人造组织器官的移植提供了原材料，因而在近期内成为全球范围内生命科学领域的焦点。但要建立ES细胞系，特别是人的ES细胞系其难度是相当大的。1981年Evans和Kaufman首次建立了小鼠的ES细胞系，以后人类经过近20年的摸索，才于1998年由美国的Thomson等建立了人类的ES细胞系，自此，ES细胞的研究也步入了高潮。归结以上ESC分离和培养的方法，其主要来源于受精卵发育形成的囊胚内细胞团及受精卵发育至桑椹胚之前的早期胚胎细胞，或者从胎儿生殖脊分离得到的原生殖细胞以及体细胞核转移至去核卵母细胞后培育出来的全能细胞。但由于从囊胚分离获得内细胞团较为困难，且ES细胞较为娇嫩、体外生长繁殖慢，最为关键的是体外培养中易丧失胚胎干性而出现分化；而已知的建系方法烦琐、复杂，重复率低，故目前在世界范围内建立的人ES细胞系较少，特别是在中国尚未见正式建系的报道。1998年我们在国际上首次报道(中山医科大学学报，1998，177)从桑椹胚内细胞团分离人ESC获得成功，并在体外连续培养6代，超过此前新加坡学者Borg.SD等的研究结果(仅传2代)，而10个月后Thomson等才报道了他们建立人ESC系的情况(1998年Science)，其主要方法与我们相同。但由于材料来源等限制，我们以上的ESC未能成功建系。本专利技术的目的是使用一套简单、方便可靠的技术，利用试管婴儿剩余的受精卵，建立中国人胚胎干细胞系。下面对本专利技术的技术方案作详细描述。1、细胞团的分离技术传统的技术是使用免疫外科的方法，首先用Dispase等特殊的蛋白酶消化囊胚外的透明带，然后用显微外科的方法分离内细胞团。这种方法获得的内细胞团比较完整，但由于受到消化酶的损伤，内细胞团活力低，生长增殖困难，因此，成功建系的几率较低，往往要使用大量的囊胚，才能获得一个正常生长的ES细胞克隆。而我们将免疫外科法改为机械法，不使用酶消化，而单纯用机械的方法去除囊胚的透明带，然后将内细胞团切割成2～3块进行培养。该法内细胞团未受到任何损伤，生长增殖正常，易于获得ES细胞克隆。2、饲养层的制备使用3～5代的小鼠胚胎成纤维细胞作为ES细胞的饲养层，但在制备饲养层时，通常将射线照射或丝裂霉素处理后的成纤维细胞消化后再传代使用。经上述条件处理后的饲养层细胞活力下降，再传代培养时细胞增殖慢，贴附力下降，排列紊乱，故影响ES细胞的生长。而我们将射线或丝裂霉素处理后的成纤维细胞直接使用，其生长情况较传代后的细胞强，易于支持ES细胞的生长，从而使得ES细胞的生长周期缩短，繁殖增快。3、培养液组成 内含20％FBS，L-谷氨酰胺1～4μmol/L，非必需氨基酸0.05～0.3μmol/L，LIF 10～20ng/ml，β-巯基乙醇0.05～0.3mmol/L。4.细胞传代培养1～4代的ES细胞克隆数量较少，一般不做消化传代，传代培养时挑取单个克隆，用解刨破剖针将克隆分割成无数小块后进行培养；而5代以后ES细胞克隆较多时可用0.1％的胶原酶消化传代。5.细胞鉴定 碱性磷酸酶染色阳性是胚胎干性的一个标志，同时使用RT-PCR法检测干细胞转录因子OCT-4的表达；胚胎干细胞表面特异性抗原检测显示人ES细胞SSEA-3，SSEA-4，TRA-1-60和GCTM-2表达阳性，而SSEA-1表达为阴性。染色体核型检查判断是否为正常核型并区分XX和XY。6.细胞分化实验 ES细胞为全能分化细胞，可通过裸鼠或SCID小鼠体内畸胎瘤形成实验证实其具有分化成三个胚层组织的能力；在体外可将其诱导分化为多种组织细胞，如内皮细胞、神经细胞和表皮样细胞等。本专利技术的优点在于1、方法简便，重复性好，成功率高 本方法屏弃了传统培养中分离内细胞团时所使用的免疫外科技术，而使用操作简单的机械法去除透明膜，快速方便，细胞损伤小，而且费用低廉，可操作性强，便于重复。而在早期传代中也没有使用传统的Dispase酶消化的方法，改用机械切割细胞克隆的技术，使获得的细胞团块较大，无损伤，细胞增殖迅速，传代时间缩短，使建系的成功率提高。2、细胞生长快速，增殖活跃，建系时间缩短 本方法在细胞传代早期均使用机械法处理细胞，损伤小，细胞团块大，易于成活，且生长快速，传代时间缩短；饲养层在处理后直接使用，对ES细胞生长的支持作用强，有利于克隆形成；培养液中使用ES专用H-DMEM培养基和胎牛血清，营养成分高，并去除了可致细胞分化和影响细胞生长的有害物，同时加入β-巯基乙醇促进细胞生长。3、建系所需的人受精卵细胞使用少 由于我们使用机械法代替免疫外科技术去除透明带，对内细胞团的损伤小，细胞成活率明显提高，能够保证每个内细胞团都能长出ES细胞克隆，因此，使得建系所需原材料-受精卵的用量较少，可减少成本，方便推广使用。下面给出实施例。一、细胞培养1.小鼠胚胎成纤维细胞的培养和处理取12d的昆明鼠胚胎去除头、尾、四肢和内脏，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗尽血迹，剪成碎片，加入0.25％的胰蛋白酶2ml，置37℃消化2～3min后，加入含5％胎牛血清的DMEM液，吹打分散细胞，静置10min，取上清，离心洗涤2次，接种于盛有含10％小牛血清的DMEM培养液的培养瓶内。第3～5代的成纤维细胞用作饲养层，用前经10μg/ml的丝裂霉素C处理1～2h，PBS液洗4～5次，在5d内使用。2.人胚胎细胞的培养用机械法去除胚泡透明带，取出内细胞团，分散后接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上，培养液为H-DMEM，内含20％胎牛血清(购于加拿大STEM CELL公司)、人白血病抑制因子(LIF，购于美国GIBCOBRL公司)、0.05～0.3μmol/L非必需氨基酸、1～4μmol/L L-谷氨酰胺和0.05～0.3μmol/Lβ-巯基乙醇。待长出单个细胞克隆后，挑出克隆，机械分离为小的细胞团，接种到新的饲养层上，培养液成分同前。待长出多个克隆后，用分散酶(Dispase)消化2～3min，或用0.1％胶原酶消化8min，离心收集细胞沉淀，进行传代培养。二、人胚胎干细胞的鉴定1、干细胞特异性表面标志物的检测市售小鼠抗人单克隆抗体SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60、GCTM-2。细胞经2％的多聚甲醛固定后，分别加入1∶50稀释的上述单克隆抗体37℃孵育2h，然后加入辣根过氧化物酶标记的抗小鼠单克隆抗体，在室温下反应30min，再用DAB(diaminobenzidine，二氨基联苯胺)孵育10min，光镜下观察并摄片。2、碱性磷酸酶(AKP)染色采用钙钴法。收集胚胎干细胞涂片，冷丙酮固定，加入AKP孵育液于37℃处理1h，蒸馏水洗3次，2％硝酸钴溶液作用5min，蒸馏水洗3次，1％硫化铵溶液处理1min，流水冲洗，常规脱水透明，中性树胶封固。细胞染蓝紫色为阳性。3、核型分析取对数生长期的细胞，加入0.4μg/ml的秋水仙素培养6h，收集细胞，用0.075mol/L的KCl 0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人胚胎干细胞系建立的方法，其特征在于：（１） 内细胞团的分离用机械法：用机械的方法去除囊胚的透明带，然后将内细胞团切割成２～３块进行培养；（２） 制备饲养层时，将射线或丝裂霉素处理后的成纤维细胞直接使用；（３） 细胞传代培养 ：１～４代传代培养时挑取单个克隆，将克隆分割成无数小块后进行培养，而５代以后细胞克隆较多时用胶原酶消化传代。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄绍良，何志旭，李予，张清学，
申请(专利权)人：中山大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]