酸枣仁多糖的制备及在制备抗肿瘤药物中的应用制造技术

酸枣仁多糖的制备及在制备抗肿瘤药物中的应用，属于植物活性成分的药物医疗和保健应用领域。依次采用有机溶剂提取、水提取、醇沉、Sevag法脱蛋白、透析分离纯化，然后浓缩冷冻干燥。该酸枣仁多糖中多糖含量为≥95.6％，且酸枣仁多糖中不含有蛋白质；肿瘤包括人宫颈癌细胞(Hela)，人肺癌细胞(A549)，人前列腺癌细胞(PC‑3)，人神经母细胞瘤细胞(SH‑SY5Y)，人乳腺癌细胞(MCF‑7)等。本发明专利技术将酸枣仁多糖用于抗癌药物的制备，以供癌症的治疗使用。

Preparation of Zizyphus Zizyphi polysaccharide and its application in the preparation of antitumor drugs

The preparation of Zizyphus jujube kernel polysaccharide and its application in the preparation of antitumor drugs belong to the medical and health application fields of plant active ingredients. Organic solvent extraction, water extraction, alcohol precipitation, Sevag deproteinized and dialysis were used in order to separate and purify, and then concentrate and freeze drying. The wild jujube polysaccharide content is more than 95.6%, and the Suanzaoren polysaccharide did not contain protein; tumor including human cervical cancer cells (Hela), human lung cancer cells (A549), human prostate cancer cells (PC 3), human neuroblastoma cells (SH SY5Y), human breast cancer cells (MCF 7) etc.. The invention uses the sour jujube kernel polysaccharide to be used in the preparation of anticancer drugs for the use of cancer treatment.

【技术实现步骤摘要】
酸枣仁多糖的制备及在制备抗肿瘤药物中的应用
本专利技术涉及一种酸枣仁多糖的抗肿瘤作用，属于植物活性成分的药物医疗和保健应用领域。
技术介绍
癌症一直是影响人类健康主要疾病之一。2014年世界卫生组织(WHO)发布的《全球癌症报告》数据显示，我国的新增癌症病例高居第一位。在肝、食道、胃和肺等4种恶性肿瘤中，中国新增病例和死亡人数均居世界首位。多糖(Polysaccharides)是一类具有广泛生物学功能的化合物，它不仅是生命体的物质基础，同时参与到细胞间的识别、机体免疫功能的调节、细胞的转化、肿瘤细胞的凋亡等生物学过程。目前对于多糖抗肿瘤、免疫调节的研究受到广泛关注。酸枣仁为鼠李科植物酸枣ZizyphusjujubaMill.var.spinosa(Bge.)HuexH.F.Chou的干燥成熟种子，味甘，性平，具宁心安神、养肝、敛汗生津之功效。主治虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴，为常用中药。酸枣仁主要含有黄酮和皂苷等镇静催眠有效成分，临床上酸枣仁主要以生品和炒制品入药。但是目前还没有发现有关酸枣仁多糖在治疗抗肿瘤方面的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酸枣仁多糖在制备抗肿瘤药物方面的新用途。本专利技术的技术方案为：对生品酸枣仁和炮制品酸枣仁进行多糖提取，再将提取的多糖作用于人宫颈癌细胞(Hela)、人肺癌细胞(A549)、人前列腺癌细胞(PC-3)、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)、人乳腺癌细胞(MCF-7)等肿瘤细胞。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种酸枣仁多糖的制备及在抗肿瘤中的应用。本专利技术所提供的酸枣仁多糖，经测试具有良好的抗肿瘤活性，在给药0.015-1.0mg/mL范围内可抑制多种肿瘤细胞的生长，且呈现明显的量效关系。本专利技术一种酸枣仁多糖的制备，包括以下步骤：1)预处理：秤取酸枣仁药材干燥粉末并加溶剂石油醚或乙醚于反应容器中，70℃-90℃(优选80℃)加热回流两次，每次1-2h优选1.5h，脱去脂肪类物质，过滤，残渣烘干；取上述残渣质量百分含量为70％乙醇水溶液回流提取2h，除去黄酮、皂苷等杂质，过滤，滤渣烘干备用；上述酸枣仁药材干燥粉末与溶剂石油醚或乙醚的质量比优选1：10；残渣与70％乙醇水溶液的质量比优选为1:25。2)水提：秤取步骤1)所得滤渣固体加入纯水，在40-70℃，180-240w下超声辅助提取30-50min，过滤，滤液备用；优选滤渣固体与纯水的用量关系10g：200-300mL；3)醇沉：将步骤2)所得的滤液减压浓缩，得浓缩液；在浓缩液中加入质量浓度95％乙醇，4℃下冷藏过夜，过滤得到沉淀，用乙醇洗涤沉淀多次并边洗涤边搅拌，然后用丙酮洗涤多次并边洗涤边搅拌，干燥，得到黄褐色酸枣仁粗多糖；优选每200-300mL滤液减压浓缩至15～30mL；浓缩液中加入4倍体积的质量浓度95％乙醇。4)Sevag法脱蛋白：将步骤3)所得的酸枣仁粗多糖用蒸馏水溶解后，加入与蒸馏水等体积的正丁醇、氯仿混合溶液混合后，离心，取上清；重复多次；所述混合溶液中，正丁醇：氯仿的体积比为1：4；5)透析分离纯化：取步骤4)中上清液，放入透析袋中，在蒸馏水中透析72h，中间不断换水；所用透析袋截留分子量为3500以上；6)将步骤5)透析袋中所得的浓缩液进行减压浓缩直至固形物含量≥30％，再冷冻干燥，得酸枣仁多糖。本专利技术酸枣仁药材干燥粉末为生品酸枣仁药材或/和炮制酸枣仁药材，炮制酸枣仁药材为生品酸枣仁药材在200-300℃炒至焦黄色，得到对应的生品酸枣仁多糖或/和炮制酸枣仁多糖。本专利技术所提供的酸枣仁多糖，主要用于癌症的治疗与辅助治疗，如：人宫颈癌细胞(Hela)、人肺癌细胞(A549)、人前列腺癌细胞(PC-3)、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)、人乳腺癌细胞(MCF-7)等，尤其对Hela、SH-SY5Y和MCF-7细胞株有较强的杀伤作用，用于制备抗肿瘤或治疗肿瘤的药物。进一步优选生品酸枣仁多糖用于制备抗人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)、人乳腺癌细胞(MCF-7)的药物；炮制品酸枣仁多糖用于制备抗人宫颈癌细胞(Hela)、人肺癌细胞(A549)的药物。利用高效液相色谱法对所得酸枣仁多糖进行分析检测，结果表明酸枣仁多糖含有D-甘露糖、D-葡萄糖醛酸、D-半乳糖醛酸、D-葡萄糖、D-半乳糖和D-阿拉伯糖等成分。采用《中国药典》2015版多糖测定方法采用苯酚-硫酸法计算酸枣仁多糖含量为95.6％；同时，用考马斯亮蓝G-250法测蛋白质为阴性，酸枣仁多糖中不含有蛋白质。本专利技术中采用的酸枣仁多糖试样的制备方法与现有同类技术相比，具有如下优点：1)极大的提高了酸枣仁多糖的纯度；2)利用酸枣仁加工过程产生的大宗副产物为原料，获得的酸枣仁多糖，其原料充足、成本低廉；解决了酸枣仁生产过程中废弃物带来的环境问题，实现了原材料的高值化利用，一举多得；3)与对照药5-氟尿嘧啶和紫杉醇相比，本专利技术的酸枣仁多糖具有较好的抑制肿瘤生长的作用；3)酸枣仁作为传统中药，通过口服途径增强机体免疫活性，起到预防保健的作用。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不限于以下实施例。表1为制备的酸枣仁多糖、对照药的五氟尿嘧啶和紫杉醇，在作用72h后，对人宫颈癌细胞(Hela)、人肺癌细胞(A549)、人前列腺癌细胞(PC-3)、人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)、人乳腺癌细胞(MCF-7)的细胞生长抑制率的对比。抗肿瘤活性检测步骤：根据样品溶解情况，用无菌生理盐水溶解样品并0.22μm滤膜过滤除菌，生品酸枣仁多糖和炮制品酸枣仁多糖样品为10mg/ml，阳性药均为10mg/ml。肿瘤细胞于37℃、5％CO2及饱和湿度环境下培养于含10％胎牛血清的完全培养基，细胞呈对数增长时铺板，调整细胞浓度至3000个/孔接种180μl完全于96孔培养板。待细胞贴壁生长12h后，加入检测样品及阳性对照药20μl，终浓度均为10μg/ml，阴性对照组和空白组同时加入等体积生理盐水，细胞共同孵育72h后，弃细胞上清，加入终浓度为0.5mg/mlMTT溶液，继续培养4h。吸弃上清，每孔加入150μlDMSO，置摇床上振荡10min，使结晶物充分溶解，于酶标仪570nm处测量吸光值。独立重复三次实验。肿瘤细胞生长抑制率(％)＝(OD对照-OD实验)/(OD对照-OD空白)×100。MTT实验中，抑制率越高，说明受试物的作用活性越强。实施例1酸枣仁多糖的制备方法，依次进行以下步骤：1)预处理：秤取100g酸枣仁药材干燥粉末并加10倍量石油醚或乙醚于圆底烧瓶中，80℃加热回流两次，每次1.5h，脱去脂肪类物质，过滤，残渣烘干。取上述残渣60g，加25倍70％乙醇回流提取2h，除去黄酮、皂苷等杂质，过滤，滤渣烘干备用。2)水提：秤取步骤1)所得固体10g，加入纯水200-300mL、在40-70℃，180-240w下超声辅助提取30-50min，过滤，滤液备用。3)醇沉：将步骤2)所得的料液减压浓缩至15～30mL，得浓缩液；在浓缩液中加入4倍体积的95％乙醇，4℃下冷藏过夜，过滤得到沉淀，用乙醇洗涤3次并边洗涤边搅拌，然后用丙酮洗涤3次并边洗涤边搅拌，干燥，得到黄褐色酸枣仁粗多糖。4)Sevag法脱蛋白：将步骤3)所得的洗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种酸枣仁多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)预处理：秤取酸枣仁药材干燥粉末并加溶剂石油醚或乙醚于反应容器中，70℃‑90℃加热回流两次，每次1‑2h，脱去脂肪类物质，过滤，残渣烘干；取上述残渣质量百分含量为70％乙醇水溶液回流提取2h，除去黄酮、皂苷等杂质，过滤，滤渣烘干备用；2)水提：秤取步骤1)所得滤渣固体加入纯水，在40‑70℃，180‑240w下超声辅助提取30‑50min，过滤，滤液备用；3)醇沉：将步骤2)所得的滤液减压浓缩，得浓缩液；在浓缩液中加入质量浓度95％乙醇，4℃下冷藏过夜，过滤得到沉淀，用乙醇洗涤沉淀多次并边洗涤边搅拌，然后用丙酮洗涤多次并边洗涤边搅拌，干燥，得到黄褐色酸枣仁粗多糖；4)Sevag法脱蛋白：将步骤3)所得的酸枣仁粗多糖用蒸馏水溶解后，加入与蒸馏水等体积的正丁醇、氯仿混合溶液混合后，离心，取上清；重复多次；所述混合溶液中，正丁醇：氯仿的体积比为1：4；5)透析分离纯化：取步骤4)中上清液，放入透析袋中，在蒸馏水中透析72h，中间不断换水；所用透析袋截留分子量为3500以上；6)将步骤5)透析袋中所得的浓缩液进行减压浓缩直至固形物含量≥30％，再冷冻干燥，得酸枣仁多糖。...

【技术特征摘要】
1.一种酸枣仁多糖的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)预处理：秤取酸枣仁药材干燥粉末并加溶剂石油醚或乙醚于反应容器中，70℃-90℃加热回流两次，每次1-2h，脱去脂肪类物质，过滤，残渣烘干；取上述残渣质量百分含量为70％乙醇水溶液回流提取2h，除去黄酮、皂苷等杂质，过滤，滤渣烘干备用；2)水提：秤取步骤1)所得滤渣固体加入纯水，在40-70℃，180-240w下超声辅助提取30-50min，过滤，滤液备用；3)醇沉：将步骤2)所得的滤液减压浓缩，得浓缩液；在浓缩液中加入质量浓度95％乙醇，4℃下冷藏过夜，过滤得到沉淀，用乙醇洗涤沉淀多次并边洗涤边搅拌，然后用丙酮洗涤多次并边洗涤边搅拌，干燥，得到黄褐色酸枣仁粗多糖；4)Sevag法脱蛋白：将步骤3)所得的酸枣仁粗多糖用蒸馏水溶解后，加入与蒸馏水等体积的正丁醇、氯仿混合溶液混合后，离心，取上清；重复多次；所述混合溶液中，正丁醇：氯仿的体积比为1：4；5)透析分离纯化：取步骤4)中上清液，放入透析袋中，在蒸馏水中透析72h，中间不断换水；所用透析袋截留分子量为3500以上；6)将步骤5)透析袋中所得的浓缩液进行减压浓缩直至固形物含量≥30％，再冷冻干燥，得酸枣仁多糖。2.按照权利要求1所述的一种酸枣仁多糖的制备方法，其特征在于，步骤1)加热回流温度为80℃，回流时间1.5h。3.按照权利要求1所述的一种酸枣仁多糖的制备方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：马东来，郑玉光，康立英，李菁，刘慧娴，温子帅，刘爱鹏，
申请(专利权)人：河北中医学院，
类型：发明
国别省市：河北,13