一种动态促进3‑羟基丙酸高产的生物传感器构建方法技术

本发明专利技术公开了一种动态促进3‑羟基丙酸(3HP)高产的生物传感器构建方法。本发明专利技术拟解决合成3HP过程中，过表达丙二酸单酰CoA羧化酶基因(acc)可提高3HP产量，但过量合成丙二酸单酰CoA对菌体产生毒害的矛盾。基于转录因子FapR对丙二酸单酰CoA敏感，利用FapR与启动子序列设计负反馈调控通路根据丙二酸单酰CoA浓度调控转录，控制丙二酸单酰CoA的合成与转化速率，在避免菌体细胞毒害的同时达到提高3HP产量的目的。前期实验发现，丙二酸单酰CoA传感控制器具有动态调控通路并有利于提高3HP产量。

A dynamic method to promote the building of 3 3-hydroxypropionic high biological sensor

The invention discloses a dynamic promote 3 hydroxy propionic acid (3HP) method to construct biosensor of high yield. The present invention is intended to solve the problem of over expression of the malonyl CoA carboxylase gene (ACC) in the process of synthesizing 3HP, which can increase the output of 3HP, but the contradiction between excessive synthesis of malonylacid CoA and the toxicity of bacteria to bacteria is achieved. Based on the transcription factor FapR is sensitive to malonyl CoA, using FapR and promoter sequence design of negative feedback regulation pathway based on malonyl CoA concentration regulation of transcription, synthesis and conversion rate control malonyl CoA, while avoiding cell toxicity to improve the yield of 3HP to. In previous experiments, it was found that the malonic acid monoyl CoA sensing controller has a dynamic regulation pathway and is beneficial to increase the output of 3HP.

【技术实现步骤摘要】
一种动态促进3-羟基丙酸高产的生物传感器构建方法
本专利技术设计了一种动态促进3-羟基丙酸(3-Hydroxypropionicacid,3HP)高产的生物传感器构建方法。利用生物传感器动态调控3HP生物合成途径中的相关基因，通过不同种类和浓度的诱导剂诱导相关基因表达，负反馈调控代谢路径中产物的产量，降低细胞毒性的同时提高菌体合成3HP的能力。
技术介绍
3HP是重要的平台化学物，在美国能源部(DOE)发布的自生物质获取的十二种平台化合物中排名第三。在化学方面，3HP是三碳非手性光学有机化合物和乳酸的结构异构体，也被称为氢丙烯酸或乙烯乳酸。由于3HP含有羟基和羧基双官能团，使得它能够用于化学品的生产，如丙烯酸，1,3-丙二醇，丙烯酸甲酯，丙烯酰胺，乙基-3HP，丙二酸，丙内酯和丙烯腈等，并且可以用作交联聚合物涂层剂，金属润滑剂和纺织品抗静电剂。此外，3HP还可以应用于聚合物的生产，其优异的玻璃化温度和高熔点，可以代替许多基于石油的传统聚合物。3HP可利用多种化学物作为前体通过化学途径合成。然而化学合成成本较高、最终产物分离困难和环境污染等缺点不利于3HP的规模化生产。利用廉价丰富的基质底物，生成具有高浓度，高产率和高转化率的3HP合成方法成为近些年研究的重点。因此，遗传工程微生物的构建及其对生物过程开发应用对于使3-HP方法在商业生产上是必要且可行的。工程菌合成3HP主要包括甘油途径和丙二酸单酰CoA途径，但由于甘油比可再生碳源、葡萄糖的成本高，因此开发廉价合成3HP主要集中在丙二酸单酰CoA途径。丙二酸单酰CoA途径以廉价碳源合成的乙酰CoA为起始化合物，过表达丙二酸单酰CoA羧化酶基因acc可提高3HP产量，但过量合成丙二酸单酰CoA对菌体产生毒害。本专利技术基于转录因子FapR具有与3HP的中间产物丙二酸单酰CoA应答的特性，根据丙二酸单酰CoA浓度构建生物传感器。利用生物传感器的负反馈调控系统，通过不同诱导剂种类及浓度的诱导，动态调控生物合成途径中相关基因的表达，降低菌体毒害并提高3HP产量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供了一种动态促进3HP高产的生物传感器构建方法。为了提高3HP产量，首先构建由乙酰CoA转化为3HP的代谢合成通路，构建两个质粒：过表达乙酰CoA羧化酶基因(acc)构成质粒pE7a-acc，过表达丙二酸单酰CoA还原酶基因(mcr)合成3羟基丙酸构成质粒pS2c-mcr。使用IPTG诱导剂诱导质粒pE7a-acc中acc的过表达，从而提高丙二酸单酰CoA的浓度，进而提高终产物3HP的产量。然而，研究表明过表达acc过量合成丙二酸单酰CoA抑制菌体生长，对菌体有一定的毒性。本专利技术为了增强丙二酸单酰CoA合成能力，同时减轻由乙酰CoA羧化酶基因过表达引起的毒性。基于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的转录因子FapR具有与丙二酸单酰CoA结合，影响RNA聚合酶调控启动子下游基因转录的特性。我们利用FapR与丙二酸单酰CoA相互作用这一特性，设计负反馈调节通路来控制丙二酸单酰CoA的合成与转化，解决菌体毒害和P3HP产量偏低的问题。前期我们在E.coli中引入FapR和受FapR调控的启动子控制器(PFR1)设计了丙二酸单酰CoA生物传感器，通过使用L-阿拉伯糖和脱水四环素(aTc)诱导重组质粒pBFR1-lacI-8FapR负面调控acc表达。FapR对丙二酸单酰CoA较为敏感，能结合到启动子的起始位点上动态调节丙二酸单酰CoA合成。即在生物传感器质粒pBFR1k-lacI-8FapR中，当丙二酸单酰CoA浓度低时，IPTG诱导启动acc过表达，提高丙二酸单酰CoA合成；当丙二酸单酰CoA浓度过高，生物传感器将打开lacI的表达，FapR与丙二酸单酰CoA形成复合物，下调acc，减少胞内游离丙二酸单酰CoA，减轻对细胞的毒害作用，并最终提高3HP产量。一种动态促进3HP高产的生物传感器构建方法，其特征在于按照以下的步骤进行：一、生物传感器动态合成3HP工程菌的构建：构建将乙酰CoA转化为丙二酸单酰CoA的质粒pE7a-acc，同时构建将丙二酸单酰CoA转化为3HP的质粒pS2c-mcr，以及由转录因子FapR调控丙二酸单酰CoA生物传感器质粒pBFR1k-lacI-8FapR，通过电转化转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，经抗性培养基筛选培养得到工程菌E.coli3HP-0。2017年6月7日将E.coli3HP-0菌种保藏并登记入册到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，菌种保藏编号为CGMCCNo.14224，分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichiacoli)，该菌株的存活性经保藏中心于6月7日检测结果为存活。二、产3HP工程菌的的活化：构建的生物传感器动态合成3HP工程菌在补充有适当抗生素的LB培养基中，于37℃，180rpm第一次过夜培养；将过夜LB培养物以1％-2％(v/v)接种到新鲜LB培养基中，将该菌种按照上述步骤再次进行活化；三、产3HP工程菌的诱导培养：将已活化的产3HP工程菌，以1％-2％(v/v)接种M9基本培养基发酵培养，待菌液OD600达到0.6-0.8时，使用不同诱导剂及诱导剂浓度对菌株进行诱导培养48h，分别通过紫外可见分光光度计和液相色谱测定3HP的OD及产量；附图说明图1为实施例1中使用诱导剂诱导菌株合成3HP的OD图；图2为实施例1中使用诱导剂诱导菌株合成3HP的产量图；图3为实施例2中使用不同浓度IPTG诱导菌株合成3HP的OD图；图4为实施例2中使用不同浓度IPTG诱导菌株合成3HP的产量图；图5为实施例3中使用不同浓度L-Arabinose菌株合成3HP的OD图；图6为实施例3中使用不同浓度L-Arabinose菌株合成3HP的产量图；具体实施方式具体实施方式一：本实施方式一种动态促进3HP高产的生物传感器构建方法，按照以下的步骤进行：一、生物传感器动态合成3HP工程菌的构建：1、构建将乙酰CoA转化为丙二酸单酰CoA的质粒pE7a-acc、将丙二酸单酰CoA转化为3HP的质粒pS2c-mcr和基于转录因子FapR设计的生物传感器质粒pBFR1k-lacI-8FapR，通过电转化转入E.coliBL21(DE3)感受态细胞中经抗性培养基筛选培养得到工程菌E.coli3HP-0，其保藏编号为CGMCCNo.14224。二、产3HP工程菌的活化：构建的生物传感器动态合成3HP工程菌在补充有适当抗生素的LB培养基中，于37℃，180rpm第一次过夜培养。将过夜LB培养物以1％-2％(v/v)接种到新鲜LB培养基中，将该菌种按照上述步骤再次进行活化。三、产3HP工程菌的诱导培养：将已活化的产3HP工程菌，以1％-2％(v/v)接种M9基本培养基发酵培养，待菌液OD600达到0.6-0.8时，使用0.4mM-0.6mMIPTG、0.001％-0.005％L-Arabinose及200nM-600nMaTc诱导剂对工程菌进行诱导培养48h，分别通过紫外可见分光光度计和液相色谱测定3HP的OD及产量。步骤一或步骤二中所述LB培养基：胰蛋白胨(Trypt本文档来自技高网...

【技术保护点】
动态促进3‑羟基丙酸(3HP)高产的生物传感器所在的工程菌株Escherichia coli 3HP‑0，其保藏编号为CGMCC No.14224。

【技术特征摘要】
1.动态促进3-羟基丙酸(3HP)高产的生物传感器所在的工程菌株Escherichiacoli3HP-0，其保藏编号为CGMCCNo.14224。2.一种动态促进3HP高产的生物传感器的方法，其特征在于能根据中间产物丙二酸单酰CoA浓度，动态调控丙二酸单酰CoA合成的乙酰CoA羧化酶基因(acc)和丙二酸单酰CoA转化为3HP的丙二酸单酰CoA还原酶基因(mcr)的转录，进而解决丙二酸单酰CoA对菌体毒害和P3HP产量偏低的问题。3.权利要求2所述的传感器，其特征在于含有枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的转录因子FapR和受FapR调控的启动子基因序列(PFR1)，还含有大肠杆菌(Escherichiacoli)的乙酰CoA羧化酶基因(acc)和乳糖操纵子调节基因(lacI)、嗜热光全绿丝菌(Chloroflexusaurantiacus)的丙二酸单酰CoA还原酶基因(mcr)。4.权利要求2所的生物传感器，构建方法按以下的步骤进行：一、含动态促进3HP高产的生物传感器工程菌的构建：构建将乙酰CoA转化为丙二酸单酰CoA的质粒pE7a-acc；同时构建将丙二酸单酰CoA转化为3HP的质粒pS2c-mcr-PrpE；以及由转录因子FapR负反馈调控丙二酸单酰CoA生物传感器质粒pBF...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘长莉，隋广超，徐启江，杨洪一，张杰，常乐，
申请(专利权)人：东北林业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23