CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法，包括：(1)利用已公布物种的全基因组序列及基因注释信息，获取基因组中具有5’-Nx-NGG-3’序列的区段(x为19～22之间的整数，N代表A/T/C/G)，作为CRISPR-Cas9系统sgRNA的候选靶点；(2)将基因组打断成22～25bp的片段并筛选以NGG结尾的，且在基因组上无重复的序列；(3)将步骤(1)的候选靶点序列与步骤(2)中筛到的序列进行比对，根据错配信息及评选公式对相应的优选序列进行筛选及排序，获取最优的全基因组sgRNA作用靶点集合。本发明专利技术还提供用于实现上述筛选方法的装置。本方法适用于所有已知基因组及其基因注释信息的物种，快速高效获得其全基因组水平的sgRNA序列全集来构建基因敲除突变体文库或基因敲除动物模型。

【技术实现步骤摘要】
CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法及装置
本专利技术涉及生物信息学、蛋白质组学、转录组学及基因工程领域，具体地说，涉及CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法及装置。
技术介绍
随着DNA测序技术的发展，许多模式生物的基因组序列信息已被公布，随后科研工作者将研究重点转向对基因功能信息的挖掘上。基因敲除动物模型一直以来是在活体动物上从事基因功能研究、寻找合适药物作用靶点的重要工具。但是传统的基因敲除方法需要通过复杂的打靶载体构建、胚胎干细胞(ES细胞)的筛选、嵌合体繁育等一系列步骤，不仅操作流程繁琐，对实验人员的技术要求很高，而且费用昂贵，耗时较长，且成功率也受到多方面因素的影响。即使对于技术相对成熟的实验室，利用传统技术构建基因敲除大、小鼠模型一般也需要很长时间。2013年，美国两个实验室在《Science》杂志发表了基于CRISPR-Cas9系统在细胞系中进行基因编辑的新方法，该系统的原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基互补配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA的复合物，该复合物可以引导核酸内切酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点切割双链DNA。而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(shortguideRNA)，即可引导Cas9对DNA的定点切割，一旦切割完成，细胞会启动各种修复方式来修补被剪掉的部分，其中最常见的是非同源末端连接(NHEJ)的修复方式，该种修复方式使得修复过程很容易出错，这就很大概率地引入使基因功能丧失的变异(如插入或者缺失部分碱基序列以造成移码突变)，这使得研究者能通过突变体来了解被编辑的基因的功能。该项技术已经被迅速应用到基因敲除斑马鱼、小鼠和大鼠等动物模型的构建之中。CRISPR-Cas9技术是继锌指核酸酶(ZFN)和TALEN等技术之后可用于定点构建基因敲除动物的新方法，具有效率高、速度快、生殖系传递能力强及简单经济的特点，在动植物模型构建的应用前景非常广阔。目前在动物研究领域，有很多基于单个功能基因进行设计的Cas9靶点，但还缺乏一套筛查全基因组靶点的成熟方法。本专利技术根据Cas9在基因组中编辑靶点的偏好性，开发了一套获取动物全基因组水平Cas9靶点序列的方法。通过此方法设计出来的靶点文库，使得CRISPR可以同时针对全基因组水平的基因靶向，获得高通量的基因突变体库，该方法在基础研究中(例如药物研发和农业)将发挥巨大作用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法。本专利技术的另一目的是提供一种筛选CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的装置。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法，包括以下步骤：(1)利用已公布物种的全基因组序列及基因注释信息，获取基因组中具有5’-Nx-NGG-3’序列的区段，作为CRISPR-Cas9系统sgRNA的候选靶点；其中，x为19～22之间的整数，N代表碱基A、T、G或C；(2)将基因组打断成22～25bp的片段并筛选以NGG结尾的，且在基因组上无重复的序列；(3)将步骤(1)的候选靶点序列与步骤(2)中筛到的序列进行比对，根据错配信息及评选公式对相应的优选序列进行筛选及排序，获取最优的全基因组sgRNA作用靶点集合。前述的方法，步骤(1)中筛选符合条件的候选靶点序列的要求是：①靶点必须落在基因的CDS区内，即起始密码子之后；②尽可能靠近基因的5’端(实验表明，靠近5’端的外显子，其功能性更强)；③优选地，每个基因提取两个外显子(选取两个外显子是为了保证基因被修饰后其功能尽可能地发生变化)，具体步骤为：以转录本为单位(若以转录本为单位，一个基因有可能重复取到同一个外显子，下文有去重复的步骤)，从基因组注释文件中获取转录本、基因ID，CDS、外显子区的起始和终止位置以及染色体号等相关信息，以每个转录本的起始密码子所在位置为标准，提取其后两个外显子的始末位置，若起始密码子后只有一个外显子，则只取一个，得到候选外显子的始末位置后，利用bedtools软件中的fastaFromBed程序获取这些外显子的序列信息，保留作为外显子NGG候选靶点序列(保存为fasta格式文件)。候选外显子的筛选设计见图1。其中，fastaFromBed程序中的-s参数的作用是获取反向互补序列，这样就得到了所有外显子的编码链序列信息，便于筛选NGG位点(不用考虑负链，但要注意位置信息)。所有外显子的编码链序列提取它们的前19～22bp序列保存成fasta格式(注意此时的始末位置信息，正负链的情况有所区别，另外由于最终在与基因组水平的NGG序列进行比对时，需去除自比的比对结果，因此就需要详尽了解每一个外显子上的NGG序列所在的基因组始末位置，正负链信息等。因此要进行相应的格式调整)。鉴于上文提到的以转录本为单位会重复取得外显子的情况，进一步对获取的序列进行了去重复处理。最后获得的基因组中所有基因上的候选靶点5’-Nx-NGG-3’序列，统计其覆盖的基因数目，外显子数目，以及候选外显子上获得的NGG位点个数。前述的方法，步骤(2)中筛选中符合条件的序列的具体步骤为：全基因组筛选采用k-mer打断、再比对找回位置的方法来定位基因组中的NGG序列。首先用jellyfish软件将基因组打断成22～25bp的片段，考虑到正负链不同，分别筛选正链以NGG结尾和负链以CCN开头的序列，保留作为基因组NGG候选靶点序列(保存为fasta格式文件)；由于利用jellyfish软件将基因组打断成22～25bp的片段后没有位置信息，因此需利用bowtie软件比对找回上述22～25bp片段所在基因组中的位置。正负链分别进行比对，比对结束后，将NGG三个碱基从正链中去除，同时将CCN三个碱基从负链中去除，保存为19～22bp的含位置信息的fasta格式文件。前述的方法，步骤(3)中比对的具体步骤为：①将步骤(1)的外显子NGG候选靶点序列与步骤(2)的基因组NGG候选靶点序列进行比对，将所有自比结果过滤掉；②筛选步骤①过滤后的比对结果中，外显子NGG候选靶点在基因组中其它位置上没有比对结果的序列，这些外显子NGG靶点在基因组中是唯一的，将这些靶点序列作为最佳候选靶点序列优先被提取出来，标注为uniquereads；③筛选步骤①过滤后的比对结果中，外显子NGG候选靶点在基因组中其它位置上仍存在比对结果的序列，若出现错配0个碱基(即在基因组其它位置完全比对上)或错配1个碱基(即在基因组其它位置比对上，且只有1个碱基错配)，表明这些序列在基因组中有重复序列存在，将这些靶点序列全部删除；④筛选步骤①过滤后的比对结果中，外显子NGG候选靶点在基因组中其它位置上仍存在比对结果的序列，若出现错配2个碱基(即在基因组其它位置比对上，但有2个碱基错配)或错配3个碱基(即在基因组其它位置比对上，但有3个碱基错配)，将这些靶点序列标注为candidatereads，这些reads的所有比对结果通过公式进行打分，打分公式如下：其中，MS代表错配罚分，本文档来自技高网...

【技术保护点】
CRISPR‑Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用已公布物种的全基因组序列及基因注释信息，获取基因组中具有5’‑Nx‑NGG‑3’序列的区段，作为CRISPR‑Cas9系统sgRNA的候选靶点；其中，x为19～22之间的整数，N代表碱基A、T、G或C；(2)将基因组打断成22～25bp的片段并筛选以NGG结尾的，且在基因组上无重复的序列；(3)将步骤(1)的候选靶点序列与步骤(2)中筛到的序列进行比对，根据错配信息及评选公式对相应的优选序列进行筛选及排序，获取最优的全基因组sgRNA作用靶点集合。

【技术特征摘要】
1.CRISPR-Cas9系统sgRNA作用靶点的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用已公布物种的全基因组序列及基因注释信息，获取基因组中具有5’-Nx-NGG-3’序列的区段，作为CRISPR-Cas9系统sgRNA的候选靶点；其中，x为19～22之间的整数，N代表碱基A、T、G或C；(2)将基因组打断成22～25bp的片段并筛选以NGG结尾的，且在基因组上无重复的序列；(3)将步骤(1)的候选靶点序列与步骤(2)中筛到的序列进行比对，根据错配信息及评选公式对相应的优选序列进行筛选及排序，获取最优的全基因组sgRNA作用靶点集合。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中筛选符合条件的候选靶点序列的要求是：①靶点必须落在基因的CDS区内，即起始密码子之后；②尽可能靠近基因的5’端；③优选地，每个基因提取两个外显子，具体步骤为：以转录本为单位从基因组注释文件中获取转录本、基因ID，CDS、外显子区的起始和终止位置以及染色体号相关信息，以每个转录本的起始密码子所在位置为标准，提取其后两个外显子的始末位置，若起始密码子后只有一个外显子，则只取一个，得到候选外显子的始末位置后，利用bedtools软件中的fastaFromBed程序获取这些外显子的序列信息，保留作为外显子NGG候选靶点序列。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中筛选中符合条件的序列的具体步骤为：首先用jellyfish软件将基因组打断成22～25bp的片段，考虑到正负链不同，分别筛选正链以NGG结尾和负链以CCN开头的序列，保留作为基因组NGG候选靶点序列；由于利用jellyfish软件将基因组打断成22～25bp的片段后没有位置信息，因此需利用bowtie软件比对找回上述22～25bp片段所在基因组中的位置。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中比对的具体步骤为：①将步骤(1)的外显子NGG候选靶点序列与步骤(2)的基因组NGG候选靶点序列进行比对，将所有自比结果过滤掉；②筛选步骤①过滤后的比对结果中，外显子NGG候选靶点在基因组中其它位置上没有比对结果的序列，这些外显子NGG靶点在基因组中是唯一的，将这些靶点序列作为最佳候选靶点序列优先被提取出来，标注为uniquereads；③筛选步骤①过滤后的比对结果中，外显子NGG候选靶点在基因组中其它位置上仍存在比对结果的序列，若出现错配0个碱基或错配1个碱基，表明这些序列在基因组中有重复序列存在，将这些靶点序列全部删除；④筛选步骤①过滤后的比对结果中，外显子NGG候选靶点在基因组中其它位置上仍存在比对结果的序列，若出现错配2个碱基或错配3个碱基，将这些靶点序列标注为candidatereads，这些reads的所有比对结果通过公式进行打分，打分公式如下：其中，MS代表错配罚分，a、b、c分别代表发生错配的碱基位置，S(ab)代表a与b的代数和，S(bc)代表b与c的代数和，S(ac)代表a与c的代数和，D(ab)代表两个错配碱基a与b的相对位置之差，D(bc)代表两个错配碱基b与c的相对位置之差，D(ac)代表两个错配碱基a与c的相对位置之差；当n＝3时，若S(ab)×D(ab)<S(bc)×D(bc)，公式则变为：若S(ab)×D(ab)>S(bc)×D(bc)，公式则变为：所有reads按照打分从低到高排序，将分数低的前10万条reads作为候选序列，即打分通过的candidatereads；⑤步骤②的uniquereads和步骤④打分通过的candidatereads即为最优的全基因组sgRNA作用靶点集合。5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)利用已公布物种的全基因组序列及基因注释信息，获取基因组中具有5’-Nx-NGG-3’序列的区段，作为CRISPR-Cas9系统sgRNA的候选靶点；其中，x为20，N代表碱基A、T、G或C；(2)将基因组打断成20bp的片段并筛选以NGG结尾的，且在基因组上无重复的序列；(3)将步骤(1)的候选靶点序列与步骤(2)中筛到的序列进行比对，根据错配信息及评选...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵毅强，高菲，王宇哲，许文杰，胥春龙，吴森，胡晓湘，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11