日本血吸虫表皮基因、其编码蛋白和应用制造技术

本发明专利技术公开了一类日本血吸虫表皮基因及其编码蛋白，还公开了与该日本血吸虫表皮蛋白特异结合的抗体。此外，本发明专利技术还公开了此类日本血吸虫表皮蛋白在制备血吸虫疫苗中的应用，以及在制备防治血吸虫病的药物中的应用。运用本发明专利技术的日本血吸虫表皮蛋白，可研究血吸虫治疗药物的作用靶点，从而在开发研制预防或治疗血吸虫病的药物过程中发挥重要作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物基因领域，具体地涉及一类日本血吸虫表皮基因、其编码蛋白，还涉及该日本血吸虫表皮蛋白的应用。
技术介绍
血吸虫病由血吸虫的感染引起，在世界上有76个国家，受感染者约1.5亿。致病的血吸虫有3种，既日本血吸虫(Schistosoma japonicum)，曼氏血吸虫(S.mansoni)和埃及血吸虫(S.haematobium)。在我国流行的是日本血吸虫。血吸虫病的流行给人民身体健康和经济发展都造成巨大的损失，因此，防治血吸虫病、开发研制治疗血吸虫病和抗血吸虫的药物具有巨大的社会和经济效益。研制新的治疗血吸虫病和抗血吸虫的药物，首先必须找到合适的药物作用靶点。血吸虫的表皮是宿主和血吸虫相互作用的界面。而组成血吸虫表皮的蛋白质暴露在这个界面上，对小分子的化学药物和大分子的抗体药物而言都是最理想的药物作用靶点。已经有研究表明治疗血吸虫的化学药物——吡喹酮的作用靶点就是存在于血吸虫的表皮。另外一些已知的血吸虫表皮蛋白，例如GST28，paramyosin，已经用于疫苗研究和应用。我们通过大规模的蛋白质组学研究，发现了50个日本血吸虫表皮蛋白质，这些蛋白质，都是可能的药物作用靶点和候选疫苗。鉴于日本血吸虫表皮蛋白的重要功能，研究和开发日本血吸虫表皮蛋白具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题之一是提供一类日本血吸虫表皮基因。本专利技术要解决的技术问题之二是提供一类日本血吸虫表皮蛋白。本专利技术要解决的技术问题之三是提供上述日本血吸虫表皮蛋白的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现在本专利技术一个方面，提供了一类日本血吸虫表皮基因，其编码具有日本血吸虫表皮蛋白质活性的核苷酸序列，所述的核苷酸序列包括(a)SEQ ID No.1～SEQ ID No.30所示的序列； (b)SEQ ID No.1～SEQ ID No.30所示的序列中每条序列的互补序列；(c)与SEQ ID No.1～SEQ ID No.30所示的序列中每条序列有至少70％同源性的序列，及(d)上述(a)～(c)中一条或数条的组合。较佳地，所述的核苷酸序列包括具有SEQ ID No.1～SEQ ID No.30所示的序列。在本专利技术的另一方面，提供了上述日本血吸虫表皮蛋白，包括(a)具有SEQ ID No.31～SEQ ID No.60所示氨基酸序列的蛋白；(b)由(a)的蛋白发生一个或几个氨基酸置换、缺失或插入而形成的具有(a)蛋白相同活性的蛋白。较佳地，其具有SEQ ID No.31～SEQ ID No.60所示的氨基酸序列。在本专利技术的另一方面，提供了一类能与上述日本血吸虫表皮蛋白特异性结合的抗体。在本专利技术中，可以使用一系列本领域已知的方法来制备针对日本血吸虫表皮蛋白的抗体。例如，将提纯的日本血吸虫表皮蛋白产物或它的抗原片段注射入动物体内以产生多克隆抗体。同样，表达日本血吸虫表皮蛋白或它的抗原片段的细胞也可以用来对动物致免疫而产生抗体。本专利技术制备的抗体也可以是单克隆抗体，这些单克隆抗体可用杂交瘤技术制备。在本专利技术的另一方面，提供了上述日本血吸虫表皮蛋白作为免疫原，在制备血吸虫疫苗中的应用。在本专利技术的另一方面，提供了上述日本血吸虫表皮蛋白在制备防治血吸虫病的药物中的应用。应用本专利技术的日本血吸虫表皮蛋白，可研究血吸虫治疗药物的作用靶点，从而在开发研制预防或治疗血吸虫病的药物的过程中发挥重要作用。附图说明图1是本专利技术日本血吸虫表皮蛋白的免疫荧光抗体原位杂交实验结果示意图。其中，T代表tegument(表皮)；G代表gut(肠道)；ST代表subtegument(下表皮)，绿色荧光部分是Immunophilin的信号。具体实施例方式下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细的说明。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1日本血吸虫表皮蛋白的分离和鉴定实验1.日本血吸虫表皮的分离纯化血吸虫表皮的纯化按照Triton-x-100提取方法进行。表皮蛋白从血吸虫雄虫、雌虫、雌雄混合成虫和童虫分离。虫体用Krebs’-Ringer’s，Tris-马来酸盐-缓冲盐液(KRTM)洗3次，再用KRTM/0.2％Triton X-100溶液悬浮。这个液体和虫体的混和物置于冰水浴中，在摇床上摇动10分钟。然后，装有液体和虫体的混和物的试管在涡旋混合器上混旋几次，然后再放回冰水浴中，静置使虫体下沉。用吸管吸出上部液体，放置到另一个新管中。这个试管在离心机上用2500×g的离心力，离心15分钟。得到的沉淀就是血吸虫的表皮。Krebs’-Ringer’s溶液的配方是0.15M NaCl，6.2mM KCl，1.2mM Na2HPO4，1.2mM MgSO4，10mM Glucose and 20mM Tris-Hepes，pH 7.4。Tris maleate缓冲溶液的配方是0.2M Tris and 0.2M Maleicanhyclride，pH 7.4。2.日本血吸虫表皮蛋白的电泳分离日本血吸虫表皮用裂解剂裂解，蛋白溶液用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，条带切割后再做第二维的在线毛细液相色谱分离以及质谱鉴定。软件分析得到鉴定蛋白。分离好的血吸虫表皮，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)缓冲液悬浮，用超声波促进组织细胞裂解和蛋白溶解，超声波裂解方法为超声1秒，暂停3秒，总时间2分钟。并用100℃加热5分钟以使蛋白质变性。然后这些表皮蛋白混合物用SDS-PAGE分离，分离方法按照普通的SDS凝胶电泳方法进行。胶上电泳泳道用刀切割下来，再用刀均等分割成8-12份。接下来做蛋白的胶内酶解。3.日本血吸虫表皮蛋白的胶内酶解过程胶内酶解按以下方法进行蛋白胶块用刀切碎，每个小块大小约为1立方毫米。加入100mM NH4HCO3，洗2次；转入到试管中；加入10mM二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)/100mM NH4HCO3，56度放置反应1小时；冷却到室温，离心吸去DTT；加入等体积的55mM碘乙酰胺iodoacetamide/100mM NH4HCO3，室温/黑暗反应45分钟；吸去iodoacetamide，加入100mM NH4HCO3，洗2次；去掉NH4HCO3，加入乙腈缩胶；去掉乙腈，真空抽干；加入100mM NH4HCO3，胶膨胀，去掉NH4HCO3，加入乙腈缩胶；去掉乙腈，抽干；加入含Trypsin的消化缓冲液(50mM NH4HCO3/12.5ng/ul trypsin)冰上放置45min；去掉多余酶液，加入50mM NH4HCO3，以刚覆盖胶为准；37度，过夜酶切；酶切结束后，从试管中吸出上清液到新管子中，胶中加入60％ACN/0.5％HAC，在水浴中超声处理15min，再重复一次；吸出上清液到新管子中，在原管子中再加入60％ACN/0.5％HAC，37度40min，吸出上清液，与前面的上清液合并，真空抽气去ACN。4.日本血吸虫表皮蛋白酶解本文档来自技高网...

【技术保护点】
一类日本血吸虫表皮基因，其编码具有日本血吸虫表皮蛋白质活性的核苷酸序列，所述的核苷酸序列包括：（ａ）ＳＥＱＩＤＮｏ．１～ＳＥＱＩＤＮｏ．３０所示的序列；（ｂ）ＳＥＱＩＤＮｏ．１～ＳＥＱＩＤＮｏ ．３０所示的序列中每条序列的互补序列；（ｃ）与ＳＥＱＩＤＮｏ．１～ＳＥＱＩＤＮｏ．３０所示的序列中每条序列有至少７０％同源性的序列，及（ｄ）上述（ａ）～（ｃ）中一条或数条的组合。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘锋，韩泽广，王志勤，胡薇，冯正，
申请(专利权)人：上海人类基因组研究中心，中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]