一种以Ｋｅａｐ１为靶点的新型防癌抗癌药物的虚拟筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种以Ｋｅａｐ１为靶点的新型防癌抗癌药物的虚拟筛选方法。包括以下步骤：１）确定Ｋｅａｐ１蛋白结构的ＰＤＢ结构数据；２）采用分子对接软件，依据ｋｅａｐ１的活性半胱氨酸残基位点确定活性中心，设定活性口袋；３）对小分子配体进行筛选；４）建立对接用小分子配体数据库；５）根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分子配体与活性口袋一一做对接；６）根据对接结果的排序，初步确定具有化学防癌或抗癌效果的先导药物。采用本发明专利技术可在短时间内获得活性化合物的线索，然后再利用动物水平筛选或者高通量细胞平台筛选具有防癌抗癌药物，大大提高了速度和效率，缩短新药研究周期。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及药物筛选方法，尤其涉及以keapl为靶点、利用分子对接的药物虚拟 筛选方法进行的新型防癌抗癌药物的筛选方法。
技术介绍
癌症是人类的大敌，尤其肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、结直肠癌、乳腺癌、鼻咽癌等发 病及死亡率近年仍居高不下。为了战胜癌症，几乎每个国家都花费了大量资金和人力。根 据世界卫生组织报告，2000年全球新发癌症病人1010万人，死亡620万人，现患癌症病例 2240万。全球癌症仍呈上升趋势，据世界卫生组织(WHO)专家预测，2020年全球总人口将 达80亿，癌症新发病例将达2000万，1200万人死于癌症，癌症将成为新世纪人类的第一杀 手。经医学界普遍认同，癌症并非死亡之神。自20世纪90年代开始，美国、加拿大、澳大利 亚等西方发达国家常见癌症开始下降，日本癌症死亡已趋平稳不再升高。这种变化，令人振 奋和鼓舞。而发展中国家增长加快，癌症病人中60%发生在发展中国家。我国2000年癌症 发病人数为200万，死亡150万。据统计，1991年-2000年我国城市居民中癌症死亡率上升 了 18. 1%，农村居民中癌症死亡率上升了 11. 03%，平均每死亡5人就有一人死于癌症。我 国正处于由发展中国家向发达国家癌谱过渡的时期。在各种致癌因子作用下，正常细胞发展成肿瘤细胞是一个长期和隐蔽过程。有充 足证据表明癌基因的持续活化或/和抑癌基因的失活是由于致癌物质对DNA不断损伤造成 的。癌变过程是由多因素引起，经历多个阶段并涉及到多条信号传递通路的异常。近数10 年研究表明癌变过程是可被放慢、阻止和逆转的。因此，阻止癌变过程是预防癌症的最有效 策略。尽管紫外线、病毒等能引起癌变，但化学致癌剂是癌变的首要因素。一般来说，化 学致癌物质进入机体后首先会被人体的解毒系统代谢。人体中肝脏的解毒机制有二道程 序分别称为Phase I与Phase II解毒系统。Phase I是第一道解毒程序，此系统主要由 Cytochrome P450酶组成，在解毒过程扮演着一个氧化与分解毒素的角色，但经Phase I活 化后的毒素有可能比原来的分子更具毒性，因此需藉由第二道的Phase II酶系统来去除 毒性；Phase II酶系统的功用即是发挥解毒作用、使这些分子失去活性，中和毒素分子对细 胞、DNA的伤害。生物体的保护系统在收到刺激后通过迅速增加II相酶的数量起到保护 作用。这种酶可以有效地抵消毒素损伤DNA并且引发癌症的能力。Phase II酶系统包括 Glutathione transferase, Quinone reductase等，都具有超强的防癌抗癌及预防细胞突 变的功能。例如其中的Quinone reductase (QR，苯醌还原酶)是研究得最为广泛的Phase II酶之一。目前认为phase II酶水平的增加可以提供对抗癌症的一个相当有效的途径。 而通过筛选具有phase II酶诱导作用的化合物可以看作是化学防癌新药研发的一个非常 有效的方法。传统的药物筛选无论是动物水平筛选还是高通量细胞平台筛选，都存在着天然 药物及食物成分复杂，从确认提取物有潜在防癌功效到确定有效成分，到最终分离出单体成分需要花费大量的人力，时间和精力，筛选化合物的速度和效率极低，周期长，阳性率低 (0.01% 0. 1%)0因此，近年来虚拟筛选方法的发展和在新药研究中的应用受到了广泛 的重视。于是建立一套高效、有效、速效的中药化学防癌药物筛选体系成为当务之急。
技术实现思路
本专利技术的目的是建立一种新颖，快速，高效的以keapl为靶点的药物虚拟筛选方 法，以弥补现有方法的不足。本专利技术的机理是研究表明，与Phase II酶的调节关系最为密切的是Keapl/Nrf2/ARE通路，这是一 个与氧化剂和亲电试剂致癌作用密切相关的信号调节系统。生理状态下，Nrf2与Keapl偶 联并与肌动蛋白结合而被锚定在胞浆中。Keapl (Kelch-like ECH-associated protein 1) 是一种泛素连接酶，与另一种连接泛素的蛋白⑶L3组成复合体与靶蛋白如转录因子Nrf2 相连。研究还发现某些具有α，β-不饱和结构单元的天然药物(迈克尔反应受体分子， 含有α，β-不饱和结构单元的化学小分子配体，其共轭结构产生的吸电子基团能与亲核 试剂发生迈克尔加成反应)，通过与Keapl半胱氨酸残基的巯基发生迈克尔加成反应，以共 价键修饰其半胱氨酸残基，促进Keapl泛素化并降解，从而使与之结合的Nrf2游离出来并 进入细胞核，与其他转录因子结合后，再结合在II相酶基因5’上游的调节抗氧化反应元件 ARE区(antioxidantresponse element, ARE)，启动第II相解毒酶和抗氧化应激蛋白基因 的转录，提高细胞抗氧化损伤的能力从而预防癌症(见图1)。因此，活化Keapl/Nrf2/ARE 通路是预防肿瘤最有前景的策略。人Keapl蛋白含有27个半胱氨酸残基位点，到底是哪些半胱氨酸残基在迈克尔受 体分子发挥II相酶诱导活性过程中发挥活性作用，一直是近十几年来化学防癌机制研究 领域的热点。Keapl研究者采用与诱导物结合的探针和酶学、放射标记、UV、色谱的检测方法 确定了 Keapl插入区的四个高活性半胱氨酸巯基位点(Cys257，CyS273，CyS288和Cys297) 是识别II相酶诱导物并与之反应的重要细胞“传感器”。而其中又以Cys273及Cys288最 为重要。体内外研究均证明Cys273及Cys288两个位点的变异或者Sulforaphane或GSSG 对野生型Keapl的加成，均可以直接导致Nrf2的解离及其II相酶及抗氧化应激靶基因表 达的增加。另外，Cysl51位点也能通过被迈克尔受体分子化合物的加成修饰，在氧化应激 诱导剂及Sulforaphane添加诱导的Keapl与Nrf2的解离中发挥重要作用。因此，能够与 keapl的Cys273与Cys288及Cysl51的活性半胱氨酸残基发生迈克尔加成反应的化合物成 为化学防癌的潜在药物。已知含有α，β _不饱和结构单元的小分子配体(称作迈克尔加成反应受体分子) 和Keapl上Cys273与Cys288及Cysl51等半胱氨酸残基的巯基发生迈克尔加成反应能有 效的上调苯醌还原酶的表达，从而起到防癌作用。但事实上并非所有的迈克尔反应受体小 分子配体都能和该活性残基发生加成反应，除了小分子配体本身应具有发生迈克尔反应的 药效基团(α，不饱和结构单元)外，其与Keapl蛋白质大分子活性口袋附近的其他氨 基酸残基之间也有相互作用，而这种相互作用，能够促使配体分子和活性半胱氨酸残基的 巯基更容易发生加成反应。基于上述机理本专利技术的构思是首先，利用同源模建软件预测出keapl活性位点所在功能域(IVR)的PDB数据；然后以此为依据，分别以keapl蛋白的活性半胱氨酸残基位 点Cysl51、Cys273及Cys288等为受体大分子的活性位点构建活性口袋，利用分子对接软 件，对预先构建的小分子配体数据库，尤其是从天然产物数据库中进行虚拟筛选，确定出能 够与该活性口袋相匹配的迈克尔反应受体小分子配体，作为具有化学防癌以及抗癌作用的 新型先导药物，再以细胞平台的高通量筛选进行本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以Ｋｅａｐ１为靶点的新型防癌抗癌药物的虚拟筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：１）确定Ｋｅａｐ１蛋白结构的ＰＤＢ结构数据；２）采用分子对接软件，依据ｋｅａｐ１的活性半胱氨酸残基位点确定活性中心，设定活性口袋；３）对小分子配体进行筛选，筛选项目为毒性筛选、类药性筛选以及药效团含有情况筛选；４）建立对接用小分子配体数据库；５）根据设定的活性口袋，利用分子对接软件，将对接用小分子配体数据库中的小分子配体与活性口袋一一做对接；６）根据对接结果的排序，初步确定具有化学防癌或抗癌效果的先导药物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：芦秀丽，高兵，曹向宇，刘剑利，陈树超，张勇，李芳瞳，
申请(专利权)人：辽宁大学，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]