多靶点联合的CAR‑T细胞制剂与制备方法技术

本发明专利技术涉及CAR‑T细胞制剂与制备方法，由以下步骤构成：i.采用基因工程技术设计多个肿瘤抗原的组合，所述的肿瘤抗原的组合包括a.CD19；以及b.CD20、CD138、CD123中的一种或两种，ii.将肿瘤抗原的组合插入到载体序列的4513和4514位置之间构成CAR，载体序列的碱基序列如SEQIDNO.1所示；iii.将CAR进行病毒包装；iv.将CAR通过病毒转染T细胞；v.通过培养基进行培养；vi.将制备的CAR‑T细胞与人血白蛋白、生理盐水混合，其中CAR‑T细胞浓度为0.5～1×10

Multiple target and CAR T cell preparation and preparation method

The present invention relates to preparation and preparation of CAR T cell preparation method comprises the following steps: I. design of multiple tumor antigens by using a combination of genetic engineering technology, the combination of tumor antigens including a.CD19, CD138, CD123 and b.CD20; in one or two, ii. will be inserted between the combination of tumor antigen the 4513 and 4514 position vector sequence CAR, sequence vector sequence is shown as SEQIDNO.1; III. CAR IV. CAR virus packaging; the virus was transfected into T cells by V.; culture medium; VI. CAR T cells with Human Albumin, saline mixture preparation, the CAR T cells the concentration of 0.5 ~ 1 * 10

【技术实现步骤摘要】
多靶点联合的CAR-T细胞制剂与制备方法[
]本专利技术涉及CAR-T细胞制剂与制备方法。[
技术介绍
]嵌合抗原受体(chimericantigenreceptor，CAR)T细胞治疗(CAR-T)技术是近年来迅速发展起来的一种肿瘤过继免疫治疗的新手段。CAR是人工构建的融合基因编码的跨膜分子，由胞外区、胞内区和跨膜区三部分构成。胞外区负责肿瘤抗原的识别，胞内区负责信号的转导，跨膜区连接胞外区和胞内区。通过将识别肿瘤相关抗原的抗体的单链可变区(single-chainvariablefragment，scFv)和胞内信号域在体外进行基因重组，生成重组质粒，采用病毒包装后再转染至患者T细胞，使患者的T细胞表达肿瘤抗原受体，转染后经过纯化和大量扩增后的T细胞，即为CART细胞。CAR能够赋予T细胞HLA非依赖的方式识别肿瘤抗原的能力。目标肿瘤抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性都是关键的决定因素。目前，尽管识别CD19靶点的CART可以成功治愈B淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤，但仍然存在治疗失败的病例，根本原因是对于有的B淋巴细胞白血病和B细胞淋巴瘤患者，CD19作为靶点的特异性不强，使CAR-T细胞不能正确识别肿瘤细胞。因此，开发多种肿瘤抗原组合的CAR，根据患者外周血中的肿瘤抗原的表达情况选择CAR，制备的CAR-T细胞，通过多靶点识别，能提高对肿瘤细胞的识别能力，确保T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。[
技术实现思路
]本专利技术提高T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤效率。为了实现上述目的，提供一种多靶点联合的CAR-T细胞制剂及其制备方法，由以下步骤构成：i.采用基因工程技术设计多个肿瘤抗原的组合，所述的肿瘤抗原的组合包括a.CD19；以及b.CD20、CD138、CD123中的一种或两种，ii.将肿瘤抗原的组合插入到载体序列的4513和4514位置之间构成CAR，载体序列的碱基序列如SEQIDNO.1所示；iii.将CAR进行病毒包装；iv.将CAR通过病毒转染T细胞；v.通过培养基进行培养；vi.将制备的CAR-T细胞与人血白蛋白、生理盐水混合，其中CAR-T细胞浓度为0.5～1×106个/毫升，CAR阳性率在25％以上，活率在95％以上。包括两种不同的CD19，所述的CD19来自人源和/或鼠源。包括两种不同的CD123序列。所述的肿瘤抗原组合为CD19-CD20、CD19-CD138、CD19-CD123、CD19-CD20-CD138、CD19-CD20-CD123、CD19-CD138-CD123。本专利技术同现有技术相比，通过建立多种不同肿瘤抗原组合的CAR-T细胞以及多靶点识别，能提高对肿瘤细胞的识别能力，确保T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。[具体实施方式]以下，结合实施例对于本专利技术做进一步说明，应当理解实施例仅用于解释说明而不用于限定专利技术的保护范围。本实施例中的CAR-T细胞制剂的制备通过以下步骤实现：a.采用基因工程技术设计多个肿瘤抗原的组合，这些抗原涉及CD19、CD20、CD138、CD123，抗原组合的方式是CD19加上另外一个抗原组合和CD19加上另外二个抗原组合，即CD19-CD20,CD19-CD138,CD19-CD123，CD19-CD20-CD138，CD19-CD20-CD123，CD19-CD138-CD123，这是根据患者外周血中的肿瘤抗原的表达而选择的，CD19、CD20、CD138、CD123的基因对于本领域的技术人员是清楚的，如CD19可选择两个序列，一条为鼠源的(CD19-1，如SEQIDNO.2所示)，一条为人源的(CD19-2，如SEQIDNO.3所示)，因此，CD19的选择可以是上述两个中的任意一个；CD20的碱基序列如SEQIDNO.4所示。CD123有两个序列，标记为CD123-1(如SEQIDNO.5所示)，CD123-2(如SEQIDNO.6所示)，CD123的选择可以是上述两个中的任意一个。CD20的碱基序列如SEQIDNO.7所示。b.载体的序列为CARVec，如SEQIDNO.1所示，将上面a.组合的序列插入到载体序列的4513和4514位置之间；c.将CAR进行病毒包装；d.将CAR通过病毒转染T细胞；e.通过培养基进行培养；f.将制备的CAR-T细胞与人血白蛋白、生理盐水混合，其中CAR-T细胞浓度为0.5～1×106个/毫升，CAR阳性率在25％以上，活率在95％以上。<110>梁爱斌，刘劼，孙毅，张文君，汪俊帮，李萍，唐晓晨，陈彩琴，朱益辉<120>多靶点联合的CAR-T细胞制剂与制备方法<160>7<210>1<211>7145<212>DNA<213>人工序列<220><223>载体序列，在位置4513和4514之间插入抗原序列<400>1caggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatac60attcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaa120aaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcat180tttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatc240agttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgaga300gttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcg360cggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctc420agaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacag480taagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttc540tgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatg600taactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtg660acaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactac720ttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggac780cacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtg840agcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcg9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多靶点联合的CAR‑T细胞制剂的制备方法，其特征在于由以下步骤构成：i.采用基因工程技术设计多个肿瘤抗原的组合，所述的肿瘤抗原的组合包括a.CD19；以及b.CD20、CD138、CD123中的一种或两种，ii.将肿瘤抗原的组合插入到载体序列的4513和4514位置之间构成CAR，载体序列的碱基序列如SEQ ID NO.1所示；iii.将CAR进行病毒包装；iv.将CAR通过病毒转染T细胞；v.通过培养基进行培养；vi.将制备的CAR‑T细胞与人血白蛋白、生理盐水混合，其中CAR‑T细胞浓度为0.5～1×10

【技术特征摘要】
1.一种多靶点联合的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于由以下步骤构成：i.采用基因工程技术设计多个肿瘤抗原的组合，所述的肿瘤抗原的组合包括a.CD19；以及b.CD20、CD138、CD123中的一种或两种，ii.将肿瘤抗原的组合插入到载体序列的4513和4514位置之间构成CAR，载体序列的碱基序列如SEQIDNO.1所示；iii.将CAR进行病毒包装；iv.将CAR通过病毒转染T细胞；v.通过培养基进行培养；vi.将制备的CAR-T细胞与人血白蛋白、生理盐水混合，其中CAR-T细胞浓度为0.5～1×106个/毫升，CAR阳性率在25％以上，活率在95％以上。2.如权利要求1所述的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于包括两种不同的CD19，所述的CD19来自人源和/或鼠源。3.如权利要求1所述的CAR-T细胞制剂的制备方法，其特征在于包括两...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁爱斌，刘劼，孙毅，张文君，汪俊帮，李萍，唐晓晨，陈彩琴，朱益辉，
申请(专利权)人：梁爱斌，刘劼，孙毅，张文君，汪俊帮，李萍，唐晓晨，陈彩琴，朱益辉，
类型：发明
国别省市：上海,31