鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法，其中，分子标记包括分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT，所述分子探针序列pSa193的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述分子探针序列pSyCTT如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术还公开了一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，本发明专利技术创造了区分野生黑麦和栽培黑麦染色体的差异性分子荧光原位杂交技术，可以为继续开展栽培黑麦和野生黑麦基因导入小麦，开展小麦分子育种服务。

【技术实现步骤摘要】
鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法
本专利技术属于生物分子检测与鉴别领域，具体地说，涉及一种鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法。
技术介绍
黑麦属(Secale，2n＝14，染色体组R)作为小麦的三级基因源，蕴藏着丰富的遗传变异，具有许多优异的农艺性状，如抗逆性强、抗白粉病、锈病、腥黑穗病和大麦黄矮病及蚜虫等多种病害，根系发达、分蘖能力强、穗大、小穗多、籽粒中赖氨酸和蛋白质含量高等，是改良普通小麦产量、抗逆性和抗病性的重要基因资源。黑麦属(Secale)有普通栽培黑麦(S.cereale)、山地黑麦(S.montanum)、非洲黑麦(S.africanum)、瓦维洛夫黑麦(S.vavilovii)和森林黑麦(S.sylivestre)等5个种。而如何将黑麦属植物的优良基因导入到普通小麦中，是近些年科研人员研究的热点(TangZX,RossK,RenZL,YangZJ,ZhangHY,ChikmawatiT,Miftahudin,GustafsonJP(2011)Wealthofwildspecies:Roleinplantgenomeelucidationandimprovement-Secale.In:WildCropRelatives:GenomicandBreedingResourcesCereals.EditedbyKoleC.Springer.pp.367-395.)。以远缘杂交结合染色体工程结合的方法，将黑麦属优异基因导入到小麦，其中以栽培黑麦1RS.1BL易位系的育成并在全世界小麦生产中的应用，最为成功(曹新有，陈雪燕，陈朝辉，王灿国，吉万全，刘建军.2014.黑麦属优异基因在小麦改良中的研究与应用。农业生物技术学报，22：1035-1045.)。但申请者发现，转移野生黑麦物种，包括非洲黑麦、森林黑麦等野生黑麦的优异基因转移研究相对缺乏，主要由于对野生黑麦染色质在小麦背景中的准确鉴定较难，且不易与栽培黑麦染色质的有效区分(LeiMP,LiGR,ZhouL,LiCH,LiuC,YangZJ.2013.Identificationofwheat-Secaleafricanumchromosome2Rafrintrogressionlineswithnoveldiseaseresistanceandagronomiccharacteristics.Euphytica194(2):197-20；AnD,ZhengQ,LuoQ,MaP,ZhangH,LiL,HanF,XuH,XuY,ZhangX,ZhouY.2015.Molecularcytogeneticidentificationofanewwheat-rye6Rchromosomedisomicadditionlinewithpowderymildewresistance.PLoSONE10(8):e0134534.)。因此，如何对不同的黑麦供体物种染色体的进行准确鉴定与追踪显得十分重要。目前，相关研究只能对栽培黑麦染色体进行鉴定，不能检测和区分野生黑麦，识别具体为那一条染色体(SchneiderA,RakszegiM,Molnár-LángM,SzakácsE.2016.Productionandcytomolecularidentificationofnewwheat-perennialrye(Secalecereanum)disomicadditionlineswithyellowrustresistance(6R)andincreasedarabinoxylanandproteincontent(1R,4R,6R).TheoreticalandAppliedGenetics129(5)：1045-1059.)。因此，迫切需要开发新型的黑麦染色体鉴定新方法，大幅度提高小麦背景中野生和栽培黑麦的鉴定效率，为分子染色体工程育种服务。建立新型基于合成寡核苷酸分子探针的非变性荧光原位杂交(ND-FSH)分子鉴定技术，作为追踪小麦背景中外源近缘物种遗传物质的最为有效的方法，但是，现有的分子探针对野生黑麦染色体上缺乏检测能力。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种鉴别栽培黑麦与野生黑麦染色体的分子检测方法，本专利技术创造了区分野生黑麦和栽培黑麦染色体的差异性分子荧光原位杂交技术，可以为继续开展栽培黑麦和野生黑麦基因导入小麦，开展小麦分子育种服务。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记，包括分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT，所述分子探针序列pSa193的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述分子探针序列pSyCTT如SEQIDNO.2所示。进一步地，分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT均带有5’FAM荧光标记，使用时探针pSa193和pSyCTT按10:1比例混合。本专利技术还提供一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，包括以下步骤：步骤1、制备黑麦染色体标本：步骤2、制备分子探针、工作液和杂交液：步骤3、原位杂交：步骤4、比对。进一步地，步骤1中的制备黑麦染色体标本具体为：步骤1.1、将种子放于浸润了双蒸水的培养皿中，放于恒温于22-24℃的培养箱中培养。待种子萌动后，放置于4℃冰箱内，使种子萌发同步，24小时后将种子上发芽梳，在22-24℃培养箱中培养；培养至种子根长至1-2cm时，剪根；步骤1.2、将剪下的根放在喷了蒸馏水的0.5ml离心管中，离心管的盖子上戳一透气孔，一氧化二氮处理2小时；步骤1.3、用体积浓度为90％的醋酸固定8分钟，蒸馏水清洗3次或者加入70％酒精放-20℃保存；步骤1.4、用滤纸将根尖上的水稍微吸干，将根尖分生组织切下，放入酶中，37℃水浴1小时；步骤1.5、用体积分数为70％的酒精洗2次，洗第二次时留一点酒精在离心管里，用解剖针将根尖捣碎，于2000转/分的转速下离心10秒，尽量将酒精倒干，加100％乙酸，每个根尖20μl，用移液枪反复吸打混匀；步骤1.6、将载玻片放在湿润的盒子里，每片滴7μl细胞悬液，盖上盒盖，5分钟后镜检，制备得到制备黑麦染色体标本。进一步地，步骤2中的制备分子探针、工作液和杂交液具体为：所述分子探针用由生物公司利用5’末端FAM荧光标记法合成寡核苷酸序列，具体为分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT，分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT均带有5’FAM荧光标记，纯化后用1xTE、pH8.0的Tris-EDTA缓冲液溶解，利于探针长期保存；使用时探针pSa193和pSyCTT按10:1比例混合；工作液是通过4SSc和2xTE的1:1混合，最终浓度为2SSC1xTE，pH7.0；-20℃保存备用；杂交液为2SSC1xTE，pH7.0的溶液。进一步地，步骤3中的原位杂交具体为：步骤3.1、将合成的探针各0.3ul加入8.0ul的2XSSC1xTE、pH7.0的杂交液之中；每张玻片加杂交液后，轻轻盖上盖玻片，在37℃湿盒中，杂交3小时以上或过夜；步骤3.2、将杂交的玻片取出，立即放在2xSSc溶液工作液中，盖玻片会自动脱落；浸泡2分钟；取出玻片用洗耳球吹干；步骤3.3、加4'本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记，其特征在于，包括分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT，所述分子探针序列pSa193的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述分子探针序列pSyCTT如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记，其特征在于，包括分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT，所述分子探针序列pSa193的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述分子探针序列pSyCTT如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，所述分子探针序列pSa193和分子探针序列pSyCTT均带有5’FAM荧光标记，使用时探针pSa193和pSyCTT按10:1比例混合。3.一种鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、制备黑麦染色体标本：步骤2、制备分子探针、工作液和杂交液：步骤3、原位杂交：步骤4、比对。4.根据权利要求3所述的鉴别黑麦野生型和栽培型的分子标记方法，其特征在于，所述步骤1中的制备黑麦染色体标本具体为：步骤1.1、将种子放于浸润了双蒸水的培养皿中，放于恒温于22-24℃的培养箱中培养。待种子萌动后，放置于4℃冰箱内，使种子萌发同步，24小时后将种子上发芽梳，在22-24℃培养箱中培养；培养至种子根长至1-2cm时，剪根；步骤1.2、将剪下的根放在喷了蒸馏水的0.5ml离心管中，离心管的盖子上戳一透气孔，一氧化二氮处理2小时；步骤1.3、用体积浓度为90％的醋酸固定8分钟，蒸馏水清洗3次或者加入70％酒精放-20℃保存；步骤1.4、用滤纸将根尖上的水稍微吸干，将根尖分生组织切下，放入酶中，37℃水浴1小时；步骤1.5、用体积分数为70％的酒精洗2次，洗第二次时留一点酒精在离心管里，用解剖针将根尖捣碎，于2000转/分的转速下离心10秒，尽量将酒精倒干，加100％乙酸，每个根尖20μl，用移液枪反复吸打混匀；步骤1.6、将载玻片放在湿润的盒子里，每片滴7...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨足君，李光蓉，郎涛，张洁，王宏晋，
申请(专利权)人：电子科技大学，
类型：发明
国别省市：四川,51