一种可控分子量海洋源硫酸软骨素的制备方法技术

一种可控分子量海洋源硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：将经处理的鱼骨料粒的料液在40‑60℃下调节pH至8‑9后酶解，酶解过程中维持pH不变；将酶解后的料液调节pH至4‑5后升温使酶解所用酶灭活，然后静置沉降后超滤；将超滤后的料液用乙醇沉淀得到一次沉淀硫酸软骨素；将所得一次沉淀硫酸软骨素用食盐水溶解，并调节溶液pH至11‑13.5，将溶液在50‑75℃下加入双氧水至过氧化氢的浓度为1‑4％氧化3小时以上；将氧化后的溶液降温后用超滤膜过滤，然后用乙醇沉淀、脱水，干燥后即得硫酸软骨素成品。本发明专利技术提供的制备方法工艺简单可行，获得的产品纯度非常高，可达99％以上，明显优于现有技术。

【技术实现步骤摘要】
一种可控分子量海洋源硫酸软骨素的制备方法
本专利技术属于医药领域，具体涉及一种可控分子量高纯度海洋源硫酸软骨素的制备方法。
技术介绍
硫酸软骨素(ChondroitinSulfate)是从动物软骨组织中提取制备的酸性粘多糖，是共价连接在蛋白质上形成蛋白聚糖的一类糖胺聚糖，分子量在10000-50000Da之间。硫酸软骨素广泛分布于动物组织的细胞外基质和细胞表面，可广泛应用于治疗心脑血管疾病、关节疼痛、关节炎以及用于滴眼液等。另一方面，随着我国蓝色经济的发展，海洋产品日益丰富人民的生活，大量海洋鱼类的骨头作为食品加工的尾料，一般经粉碎后作为饲料等低附加值使用，而从海洋鱼类骨提取硫酸软骨素等高附加值产品成为近些年研究的重点课题之一。传统的硫酸软骨素生产工艺包括碱解法和酶解法等。碱解法生产的软骨素收率低，杂质多，已基本被淘汰，目前大多数硫酸软骨素生产企业采用酶解法。酶解法利用碱性蛋白酶，2709酶或胰酶等将硫酸软骨素从软骨组织中分离，再经树脂吸附，乙醇沉淀或者超滤等工艺步骤进行纯化，经双氧水脱色后乙醇沉淀，脱水干燥制得，如CN105418800A、CN104531817A、CN104418957A等中公开了酶解法制备硫酸软骨素。酶解法的收率相比碱解法大大提高，并且主要杂质蛋白质含量通常能达到2％～6％，硫酸软骨素含量达到90％～98％。硫酸软骨素分子由氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子交替连接组成，氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间由1,4糖苷键连接。硫酸软骨素分子在碱性条件下稳定存在，而在酸性条件下不稳定，在pH值低于4的情况下氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸分子间1,4糖苷键极易断裂而降解成低分子量或者单独的二糖单元。传统的生产低分子量硫酸软骨素的方法是利用硫酸软骨素裂解酶在碱解或酶解步骤下对硫酸软骨素分子进行切割，所获得硫酸软骨素分子量范围宽，分子链不完整，且生产过程分子量难以控制，导致生产的产品与期望分子量范围差异大，且产品纯度也有待进一步提高。如CN103342758A公开了一种低分子量硫酸软骨素及其在制备抗阿尔茨海默病的药物中的应用，该专利技术利用酸性条件下(pH值为5)用双氧水处理，处理时间为8～12小时，反应温度为60～70℃，得到降解的低分子量硫酸软骨素，再采用超滤膜截留分子量5000道尔顿以下的硫酸软骨素。利用该专利技术生产出来的产品存在以下缺陷：①硫酸软骨素分子不完整，含有大量氨基葡萄糖和葡萄糖醛酸单糖分子；②采用5000道尔顿的超滤膜截留，期望获得的产品，低于5000Da的产品与双氧水和其他低分子量杂质会共同存在于母液中，产品杂质多，且产品中含有基因毒性杂质双氧水，给患者使用带来风险；③大于5000Da的产品无法利用，造成了巨大的浪费；④硫酸软骨素市场需要不同的规格，按照其制备方法，仅仅获得5000Da以下的产品，无法获得其他分子量段产品。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的在于提供一种可控分子量高纯度海洋源硫酸软骨素的制备方法。本专利技术的方法可实现硫酸软骨素分子量可控，并且生产的硫酸软骨素颜色洁白，主要杂质蛋白质含量低于2.0％，硫酸软骨素含量达到99％以上。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术手段：一种可控分子量海洋源硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：(1)将经处理的鱼骨料粒的料液在40-60℃，例如为42℃、46℃、51℃、55℃、59℃等下调节pH至8-9，例如为8.2、8.4、8.8等后酶解，酶解过程中维持pH不变；(2)将步骤(1)酶解后的料液调节pH至4-5，例如为4.2、4.4、4.6、4.8等后升温使酶解所用酶灭活，然后静置沉降后超滤，以除去料液中的大部分杂质；(3)将步骤(2)超滤后的料液用乙醇沉淀得到一次沉淀硫酸软骨素，其纯度92％左右，蛋白质含量7％左右，分子量30000Da左右；(4)将步骤(3)所得一次沉淀硫酸软骨素用食盐水溶解，并调节溶液pH至11-13.5，例如为11.4、11.9、12.3、12.8、13.3等，将溶液在50-75℃，例如为53℃、56℃、59℃、62℃、66℃、69℃、73℃等下加入双氧水至过氧化氢的质量浓度为1-4％，例如为1.3％、1.7％、1.9％、2.4％、2.8％、3.3％、3.7％等，优选2％氧化3小时以上，例如为5小时、8小时、10小时、14小时、17小时、20小时等，可调节氧化时间的长短来控制目标产品的分子量在期望范围内；双氧水氧化的原理是通过双氧水的弱氧化性和破坏性，使硫酸软骨素分子间的糖苷键断裂，从而使其分子量降低，同时由于其氧化性可以为产品脱色并除去部分杂质和微生物；(5)将步骤(4)氧化后的溶液降温后用超滤膜过滤，以除去溶液中多余的氯化钠、双氧水以及氧化过程产生的如硫酸盐等杂质，然后用乙醇沉淀、脱水，干燥后即得硫酸软骨素成品。本专利技术通过技术革新，在酶解超滤的基础上，通过氧化脱色步骤在碱性条件下，控制氧化温度和加入双氧水的量以及氧化时间来调节硫酸软骨素氧化的程度，并利用双氧水的弱氧化性破坏硫酸软骨素分子结构使硫酸软骨素高分子在碱性条件下水解，再通过超滤的工艺步骤将氧化过程产生的杂质和多余的双氧水去除，从而既达到了脱色的目的，也控制了其分子量范围。并且本专利技术的方法生产的硫酸软骨素颜色洁白，主要杂质蛋白质含量低于2.0％，硫酸软骨素纯度达到99％以上。作为优选，步骤(1)中所述处理为将鱼骨料粒加水煮沸。优选地，所述鱼骨料粒与水的比例为1:2-10kg/L，优选为1:3-6kg/L，进一步优选为1:4.5kg/L。优选地，所述煮沸的时间为0.5小时以上，优选为1-5小时。优选地，料液在45-55℃，优选48-50℃下调节pH至8-9，优选为8.5±0.2。优选地，所述调节使用NaOH溶液进行。优选地，所述NaOH溶液的质量浓度为10-50％，优选为20％。优选地，所述酶解使用胰酶。优选地，所述胰酶的加入量为鱼骨料质量的0.1-1％，优选为0.1-0.5％，进一步优选为0.3％。优选地，所述酶解进行至无明显骨头残渣，优选为至无骨头残渣。作为优选，步骤(2)中料液调节pH至4.5±0.2。优选地，所述调节使用盐酸进行。优选地，所述盐酸的质量浓度为8-30％，优选为10-20％，进一步优选为15％。优选地，所述升温为升温至70-90℃，优选为80℃。优选地，所述静置沉降的时间为1小时以上，优选为2小时。优选地，所述超滤在超滤罐中进行。优选地，所述超滤的时间为5小时以上，优选为10小时。作为优选，步骤(3)中所述沉淀在沉淀罐中进行。优选地，沉淀时使用95％乙醇，优选边搅拌边加入。优选地，沉淀时醇沉体系的乙醇体积浓度为60-80％，优选为70％。优选地，沉淀时醇沉体系静置过夜。作为优选，步骤(4)中所述食盐水质量浓度为0.5-2％，优选为0.9％。优选地，加入食盐水的量使硫酸软骨素质量浓度为5-20％，优选为10％。优选地，调节溶液pH使用氢氧化钠溶液。优选地，所述氢氧化钠溶液的质量浓度为10-40％，优选为20％。优选地，调节溶液pH至12-13。优选地，溶液在60-65℃下加入双氧水。优选地，所述双氧水的质量浓度为30-70％，优选为50％。作为优选，步骤(5)中所述超滤膜为10000超滤膜。优选地，所述乙醇为95％乙醇。作为优选，本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可控分子量海洋源硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：(1)将经处理的鱼骨料粒的料液在40‑60℃下调节pH至8‑9后酶解，酶解过程中维持pH不变；(2)将步骤(1)酶解后的料液调节pH至4‑5后升温使酶解所用酶灭活，然后静置沉降后超滤；(3)将步骤(2)超滤后的料液用乙醇沉淀得到一次沉淀硫酸软骨素；(4)将步骤(3)所得一次沉淀硫酸软骨素用食盐水溶解，并调节溶液pH至11‑13.5，将溶液在50‑75℃下加入双氧水至过氧化氢的浓度为1‑4％氧化3小时以上；(5)将步骤(4)氧化后的溶液降温后用超滤膜过滤，然后用乙醇沉淀、脱水，干燥后即得硫酸软骨素成品。

【技术特征摘要】
1.一种可控分子量海洋源硫酸软骨素的制备方法，包括如下步骤：(1)将经处理的鱼骨料粒的料液在40-60℃下调节pH至8-9后酶解，酶解过程中维持pH不变；(2)将步骤(1)酶解后的料液调节pH至4-5后升温使酶解所用酶灭活，然后静置沉降后超滤；(3)将步骤(2)超滤后的料液用乙醇沉淀得到一次沉淀硫酸软骨素；(4)将步骤(3)所得一次沉淀硫酸软骨素用食盐水溶解，并调节溶液pH至11-13.5，将溶液在50-75℃下加入双氧水至过氧化氢的浓度为1-4％氧化3小时以上；(5)将步骤(4)氧化后的溶液降温后用超滤膜过滤，然后用乙醇沉淀、脱水，干燥后即得硫酸软骨素成品。2.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述处理为将鱼骨料粒加水煮沸；优选地，所述鱼骨料粒与水的比例为1:2-10kg/L，优选为1:3-6kg/L，进一步优选为1:4.5kg/L；优选地，所述煮沸的时间为0.5小时以上，优选为1-5小时。3.根据权利要求1或2中所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中料液在45-55℃，优选48-50℃下调节pH至8-9，优选为8.5±0.2；优选地，所述调节使用NaOH溶液进行；优选地，所述NaOH溶液的质量浓度为10-50％，优选为20％。4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述酶解使用胰酶；优选地，所述胰酶的加入量为鱼骨料质量的0.1-1％，优选为0.1-0.5％，进一步优选为0.3％；优选地，所述酶解进行至无明显骨头残渣，优选为至无骨头残渣。5....

【专利技术属性】
技术研发人员：尤加宇，赵贵吉，张新庆，申加秋，刘英豪，化春梅，王洪英，马海霞，赵梦喆，马锡峰，
申请(专利权)人：日照岚山生化制品有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37