一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法技术

本发明专利技术公开了一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，所述方法为：将纳米氧化锌悬浮于缓冲液中制成纳米氧化锌悬液，然后将纳米氧化锌悬液经腹腔注射小鼠，连续注射30天，每天一次，成功构建纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型；所述纳米氧化锌悬液的注射量以纳米氧化锌质量计为50‑150mg/kg；本发明专利技术建立的动物模型具有制备简单、稳定可靠、可重复等特点，该模型对深入研究重金属中毒的发病机制的探讨以及药物的开发提供的新的途径和思路。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种动物模型的构建，特别涉及一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法。(二)
技术介绍
随着纳米技术的发展，纳米材料越来越多地进入到人们的生活，纳米颗粒由于其小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应，使其广泛应用于医学及化工工业。但是，纳米颗粒有其特殊的生物活性，也使得其具有某些特殊的毒性。越来越多的研究在关注应用纳米材料的同时，也关注纳米颗粒对人类健康和环境的潜在的影响。与普通锌相比，纳米氧化锌在电学、光学、国防、纺织和饲料工业等众多方面具有更优异的性能，现已广泛应用于环保材料、陶瓷材料、纺织、饲料添加剂等许多领域。纳米氧化锌具有强大的抗菌活性，在卫生、保健、医学等领域也得到了广泛应用例。随着产品的不断开发和应用，人们在日常生活和工作中接触到纳米氧化锌的机会越来越多，纳米锌粒子也因此获得了多种途径进入人体并与体内不同组织、细胞或生物分子相互作用的可能。特别是在医学、生物学领域，纳米氧化锌产品可直接应用于人体，与血液、体液或淋巴系统接触。与其他纳米材料相比，除了分散在空气中纳米氧化锌可经呼吸道或皮肤进入人体外，医用产品中的纳米氧化锌更易直接进入血液循环系统，并可能分布于全身其他脏器而产生毒副作用。纳米氧化锌之所以对细胞产生毒性，是因为纳米锌可以消弱线粒体功能，增加膜通透性，引起细胞凋亡。然而，与纳米氧化锌的快速市场化形成鲜明对比的是，人们对于不同途径进入体内的纳米氧化锌可能产生的负面生物效应或毒副作用还知之甚少，对纳米氧化锌在体内的吸收、分布、代谢、排泄等体内行为也缺乏系统研究，这将对纳米氧化锌的进一步应用带来潜在影响。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，为研究纳米氧化锌对生物体和环境造成的影响，阐明纳米材料在体内外的特殊性质，揭示纳米效应引起的毒性和生物活性，促进纳米锌材料在未来的生物应用中的研究提供参考，使其更安全、广泛地贡献人类社会。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，所述方法为：将纳米氧化锌悬浮于缓冲液中制成纳米氧化锌悬液，然后将纳米氧化锌悬液经腹腔注射小鼠，连续注射30天，每天一次，成功构建纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型(通常在注射结束后第3天，脱臼处死小鼠，检测小鼠血清锌含量以及肝组织SOD活力、MDA、CAT、NO的含量；取肝组织，进行肝细胞凋亡的TUNEL法检测；利用RT-PCR对小鼠肝脏c-myc基因和p53基因表达进行检测，筛选肝细胞凋亡的模型为本专利技术所述的动物模型，通常凋亡率为60-80％)；所述纳米氧化锌悬液的注射量以纳米氧化锌质量计为50-150mg/kg。进一步，所述纳米氧化锌粒径为47.8±5.7nm。进一步，所述纳米氧化锌悬液浓度为10mg/mL。进一步，所述缓冲液为pH7.0、10mM磷酸盐缓冲液。进一步，所述小鼠为2-3月龄的ICR小鼠。进一步，所述纳米氧化锌悬液的注射量以纳米氧化锌质量计为125mg/kg。所述的TUNEL法检测肝细胞凋亡步骤如下：取部分肝组织制备石蜡切片，将石蜡切片常规脱蜡、水化，采用美国R&D公司过氧化物酶试剂盒，用荧光素标记，然后用结合了过氧化物酶的抗荧光素抗体与荧光素结合，再与底物DAB进行显色反应，在光学显微镜下阅片，拍照。所述的SOD的活力采用黄嘌呤氧化酶法进行测定，MDA的含量采用硫代巴比妥酸法进行测定，CAT的含量采用可见光法进行测定，NO的含量采用硝酸还原酶法测定，血液锌的含量用原子吸收分光光度法测定。与现有技术相比，本专利技术有益效果主要体现在：本专利技术建立的动物模型具有制备简单、稳定可靠、可重复等特点，该模型对深入研究重金属中毒的发病机制的探讨以及药物的开发提供的新的途径和思路。(四)附图说明图1纳米氧化锌粒径扫描电镜图。图2本专利技术所建模型的肝细胞凋亡的电镜观测图。图3为TUNEL法检测肝细胞凋亡图。(五)具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术进行进一步描述，但本专利技术的保护范围并不仅限于此：实施例所采用的试剂和设备：1.10mg/mL的纳米氧化锌悬液：精密称取100mg纳米氧化锌加入到10mL、pH7.0、10mM的PBS中，压力蒸汽灭菌后(121℃×15min)，4℃贮存。通过JEOLJSM-5610LV扫描电镜扫描，保存图像，用SmileView软件打开并进行测量确定其粒径及分布。本专利技术所用纳米氧化锌混悬液粒子粒径为47.8±5.7nm(图1)。2.2-3月龄普通级ICR小鼠，由浙江省医学科学研究院实验动物中心提供。3.磷酸盐缓冲液(PBS)，青霉素-链霉素，L-谷胺酰胺购自购自Gibco；0.25％胰酶(Typsin)购自Sigma；超氧化物歧化酶试剂盒、考马斯亮蓝蛋白试剂盒、丙二醛试剂盒购自南京建成生物工程研究所。4.仪器设备：扫描电镜(JSM-5610LV，JEOL)；酶标仪(Genios，Tecan)；倒置荧光显微镜(DMI4000B，Leica)；冷冻高速离心机(MICRO22R)；透射电镜(JEM-1230)；超薄切片机(Reichert)、轮转切片机(LeicaRM2016)。实施例1小鼠的染毒试验(1)将健康的2-3月龄普通级ICR小鼠随机分成5个模型组(模型组1-模型组5)和1个生理盐水对照组，每组均为14只，雌雄各半，分笼饲养。(2)5个模型组小鼠每天经腹腔注射剂量分别为50mg/kg、75mg/kg、100mg/kg、125mg/kg和150mg/kg的纳米氧化锌(纳米氧化锌以10mg/mL纳米氧化锌悬液的形式加入)，连续30天，诱导小鼠肝细胞凋亡；对照组小鼠每天经腹腔注射生理盐水，剂量为25mL/kg，连续30天。实施例2不同剂量纳米氧化锌对小鼠血清锌以及肝组织SOD活力、MDA、CAT、NO的含量的影响用实施例1方法对小鼠腹腔注射不同剂量纳米氧化锌悬液进行染毒，注射结束后第3天，检测小鼠血清锌含量以及肝组织SOD活力、MDA、CAT、NO的含量。(1)肝细胞生物指标检查：检测肝组织SOD活力、MDA、CAT和NO的含量。SOD的活力采用黄嘌呤氧化酶法进行测定，MDA的含量采用硫代巴比妥酸法进行测定，CAT的含量采用可见光法进行测定，NO的含量采用<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，其特征在于所述方法为：将纳米氧化锌悬浮于缓冲液中制成纳米氧化锌悬液，然后将纳米氧化锌悬液经腹腔注射小鼠，连续注射30天，每天一次，成功构建纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型；所述纳米氧化锌悬液的注射量以纳米氧化锌质量计为50‑150mg/kg。

【技术特征摘要】
1.一种纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立方法，其特征
在于所述方法为：将纳米氧化锌悬浮于缓冲液中制成纳米氧化锌悬液，然后
将纳米氧化锌悬液经腹腔注射小鼠，连续注射30天，每天一次，成功构建纳
米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型；所述纳米氧化锌悬液的注射量以
纳米氧化锌质量计为50-150mg/kg。
2.如权利要求1所述纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞凋亡动物模型的建立
方法，其特征在于所述纳米氧化锌粒径为47.8±5.7nm。
3.如权利要求1所述纳米氧化锌诱导的小鼠肝细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：庄海峰，林婉冰，沈建平，陈峥，雷澍，庄晓芬，
申请(专利权)人：浙江省中医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33