一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒及其使用方法技术

本发明专利技术提供了一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒及其使用方法，该技术方案首先通过实验发现gyrB基因作为单拷贝的看家基因，比常规的16S rRNA在区分和鉴定维氏气单胞菌及其近缘种上具有更显著的优势；同时发现Aha基因稳定存在于维氏气单胞菌中，并与其毒力存在关联。基于以上有益的发现，本发明专利技术选用gyrB基因和Aha基因作为靶基因开发了针对维氏气单胞菌双重PCR检测方法，该方法围绕两种靶基因设计了特异性引物，并围绕其确定了PCR反应体系和反应条件。本发明专利技术对维氏气单胞菌检测敏感性强、特异性高，可以快速、准确地检测黄颡鱼源致病性维氏气单胞菌，有效避免错检漏检。同时避免了反复培养、冗长的一系列生化反应，节约时间、劳动力和成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程
，进一步涉及基于基因工程技术的生物检测方法，具体涉及一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
黄颡鱼(Pelteobagrusfulvidraco)俗称郎丝、黄腊丁、江颡，属鲶形目(Siluriformes)，鲿科(Bagridae)，黄颡鱼属(Pelteobagrus)，是我国江河湖泊常见的一种底栖小型经济鱼类，因其肉质细嫩，味道鲜美，深受消费者青睐。然而，作为易患病鱼类品种，黄颡鱼的养殖过程中时常有病害发生，报道的常见疾病主要有细菌性疾病、霉菌病、寄生虫、营养性疾病等。其中又以细菌性疾病危害最为严重，易导致黄颡鱼大规模死亡，给养殖户造成重大经济损失。导致黄颡鱼发病病原菌包括嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、舒伯特气单胞菌、维氏气单胞菌等。其中由维氏气单胞菌所引起疾病，是近年来在鲿科鱼类中时常出现的暴发性细菌病，症状表现为患病黄颡鱼体色加深、体表黏液增多，体表多处溃烂，肛门红肿出血、外突，头部下颌、鳃盖、鳍条基部充血发红，腹部膨胀。解剖腹腔中有大量粉红色腹水，肝脏肿大发白，肠壁糜烂，胆囊肿大。患病初期只有少量鱼死亡，后期出现大规模死亡，死亡率达到90％以上，通过分离鉴定确定该病的致病菌为维氏气单胞菌。在此类疾病的防治工作中，及早诊断是控制疫情的关键环节，因此除了对症状的观察之外，直接针对病原微生物的分离检测显得尤为重要。维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)是革兰氏阴性杆菌，菌体略弯曲，属兼性厌氧菌，菌体大小为0.3～0.7μm×1.2～2.5μm。25～30℃时生长良好，在2～10℃的低温条件下以及42℃的较高温度条件下也可生长繁殖。该菌在普通营养琼脂上生长旺盛，培养24h后菌落直径多在1.3mm，呈圆形、边缘整齐、表面光滑、灰白色，不透明、中央稍隆起，在血平板上生长良好，能形成明显的β-溶血。现有技术中针对维氏气单胞菌的检测方法较为粗放，普遍采用分离培养的方式，再通过对菌落特征或菌体特征的观察加以鉴定，其操作繁琐，耗时较长且准确性不高。现有技术中有研究者尝试通过PCR方式以特异性基于作为检测对象实现对维氏气单胞菌鉴定检测，然而目前阶段相关方法普遍以维氏气单胞菌16SrRNA和核酸酶基因作为检测的靶基因，实践发现其特异性不够理想，再加之引物设计和PCR条件不够合理等因素，导致检测的准确性、操作速度仍有待提升。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒及其使用方法，以解决现有技术中基于PCR技术的维氏气单胞菌检测方法准确性较低的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术中基于PCR技术的维氏气单胞菌检测方法由于所选择的检测靶基因不合理所导致的准确性较低的技术问题。本专利技术要解决的再一技术问题是现有技术中针对维氏气单胞菌的部分检测方法操作繁琐、耗时较长。本专利技术要解决的又一技术问题是本专利技术以gyrB基因和Aha基因为靶基因的维氏气单胞菌PCR检测方法，其引物性能有待提升。本专利技术要解决的又一技术问题是本专利技术以gyrB基因和Aha基因为靶基因的维氏气单胞菌PCR检测方法，其PCR扩增效果不佳。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，该试剂盒包括针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物和针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物。作为优选，所述针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物是序列如SEQIDNO.1所示的上游引物和如SEQIDNO.2所示的下游引物。作为优选，所述针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物是序列如SEQIDNO.3所示的上游引物和如SEQIDNO.4所示的下游引物。作为优选，所述试剂盒还包括10×PCRbuffer，dNTP，MgCl2，rTaqDNA聚合酶，阳性质控品，阴性质控品。作为优选，所述试剂盒还包括作为阳性质控品的维氏气单胞菌菌液和作为阴性质控品的ddH2O。同时，本专利技术还提供了一种应用上述试剂盒检测维氏气单胞菌的方法，包括以下步骤：1)以待测样品溶液为PCR模板，以序列如SEQIDNO.1所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因上游引物，以序列如SEQIDNO.2所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因下游引物，以序列如SEQIDNO.3所示的DNA片段为维氏气单胞菌Aha基因上游引物，以序列如SEQIDNO.4所示的DNA片段为维氏气单胞菌Aha基因下游引物执行双重PCR扩增，得到扩增产物；2)取步骤1)所得的扩增产物执行琼脂糖凝胶电泳，确认电泳结果中745bp处或419bp处是否具有条带。作为优选，所述待测样品溶液是从黄颡鱼组织器官中分离出的微生物菌液。作为优选，所述双重PCR扩增的反应体系如下：待测样品溶液1μL，10×PCRbuffer2.5μL，5U/μL的rTaqDNA聚合酶溶液0.25μL，250mmol/L的MgCl2溶液1.5μL，20μmol/L的gyrB基因上游引物0.5μL，20μmol/L的gyrB基因下游引物0.5μL，20μmol/L的Aha基因上游引物0.6μL，20μmol/L的Aha基因下游引物0.6μL，2.5mmol/L的dNTP溶液0.5μL，ddH2O补齐至25μL。作为优选，所述双重PCR扩增的反应条件如下：94℃预变性4min；94℃变性30s，55～65℃退火30s，72℃延伸30s，反应30～35次循环；72℃再延伸10min。作为优选，所述退火的温度是61℃，反应循环次数为30次。在以上技术方案中，所述阳性质控品和阴性质控品又分别称为阳性对照和阴性对照，二者分别为明确具有目的菌(维氏气单胞菌)的菌液和明确不具有目的菌的ddH2O；二者作为PCR检测的参照物。在以上技术方案中，出现于745bp和419bp位置的条带分别用于表征gyrB基因和Aha的存在，在实际操作中，当一次检测同时出现上述两条条带的情况下可以认定为维氏气单胞菌阳性，仅有一条条带或不存在条带的情形则应当认定为维氏气单胞菌阴性。本专利技术提供了一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒及其使用方法，该技术方案以促旋酶的B亚单位基因(gyrB)和黏附素基因(Aha)为靶基因设计了两对针对黄颡鱼源致病性维氏气单胞菌的高度特异性引物。gyrB基因是单拷贝的看家基因，平均碱基替换率为每100万年变化0.7％～0.8％，比16SrDNA的每5000万年变化1％的速度要快，而且不发生水平转移，并普遍存在于各种细菌中。本专利技术通过实验手段发现gyrB基因比16SrRNA在区分和鉴定维氏气单胞菌及其近缘种上具有更显著的优势。Aha基因最早发现于1961年，被认为与大肠杆菌菌毛的合成有关，由于菌毛的附着力影响着许多致病菌的定殖能力，因此Aha基因被认为与部分致病菌的毒力有关。本专利技术人从患病黄颡鱼中分离的维氏气单胞菌中克隆了Aha基因，并发现具有致病性的维氏气单胞菌中Aha基因呈阳性。基于这种有益的发现，本专利技术选用其与gyrB基因共同作为PCR扩增的靶基因。在此基础上，本专利技术设计了两组高特异性的检测引物，并围绕其建立了双重PCR的反应体系和反应条件，在此基础上形成了针对维氏气单胞菌检测试剂盒。该试剂盒的敏感性强、特异性高，可以快速、准确地检测黄颡鱼源致病本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物和针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物。

【技术特征摘要】
1.一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物和针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物。2.根据权利要求1所述的一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，其特征在于所述针对维氏气单胞菌gyrB基因的一对引物是序列如SEQIDNO.1所示的上游引物和如SEQIDNO.2所示的下游引物。3.根据权利要求2所述的一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，其特征在于所述针对维氏气单胞菌Aha基因的一对引物是序列如SEQIDNO.3所示的上游引物和如SEQIDNO.4所示的下游引物。4.根据权利要求3所述的一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括10×PCRbuffer，dNTP，MgCl2，rTaqDNA聚合酶，阳性质控品，阴性质控品。5.根据权利要求4所述的一种针对维氏气单胞菌的检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括作为阳性质控品的维氏气单胞菌菌液和作为阴性质控品的ddH2O。6.一种应用权利要求4所述试剂盒检测维氏气单胞菌的方法，其特征在于包括以下步骤：1)以待测样品溶液为PCR模板，以序列如SEQIDNO.1所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因上游引物，以序列如SEQIDNO.2所示的DNA片段为维氏气单胞菌gyrB基因下游引物，以序列如SEQIDNO.3所示的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱成科，刘桂嘉，周朝伟，郑宗林，张争世，朱龙，李艳苹，杨成年，
申请(专利权)人：西南大学，
类型：发明
国别省市：重庆;50