多种转基因元件同时快速检测的方法技术

本发明专利技术提供了一种多种转基因元件同时快速检测的方法，包括如下步骤：步骤1、多壁碳纳米管/氧化石墨烯纳米带MWCNTs/GONRs分散液的制备；步骤2、绿色碲化镉量子点溶液和红色碲化镉量子点溶液的制备；步骤3、碲化镉量子点‑捕获探针分散液的制备；步骤4、荧光共振能量转移传感体系的构建；步骤5、标准曲线的构建；步骤6、基于荧光共振能量转移传感体系对转基因大豆的检测。该传感器的制备是基于DNA互补配对杂交特异性作用所构建的，因而相对于免疫反应而言有与目标分子结合力强、特异性高、长时间暴露不容易变性、对周围环境要求不高等特点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于荧光共振能量转移领域，特指多种转基因元件同时快速检测的方法，具体为荧光共振能量转移传感器的制备及对转基因中启动子和终止子的快速检测方法。
技术介绍
转基因作物(GeneticallyModifiedOrganisms，简称GMOs)是指利用生物技术，把从动物、植物或微生物等生物体中经鉴定、分离的基因插入植物基因组中，改变其遗传组成，产生新的农艺性状的植物，所引入的外源基因一般包括启动子，目的基因，终止子。目前转基因检测方法主要有酶联免疫吸附法(ELISA)、免疫试纸条法和蛋白质芯片，聚合酶链式反应(PCR)法等。但是基于蛋白的检测方法背景信号高、蛋白质活性难以长久保持、开发特异性抗体的成本高、加工过的转基因产品其蛋白质发生变性而无法进行检测。基于RAN的检测收到RNA容易降解和对实验条件要求较高的限制，从而较难普及。而尽管PCR方法是高灵敏度的DNA水平检测方法，但是常伴有各种假性结果出现：一方面，DNA提取时产生的各种反应抑制因子，可能使PCR呈假阴性；另一方面，PCR过程中容易引入非特异性扩增，从而使PCR呈假阳性。此外，PCR样品需要量大，操作繁琐，检测时间长，还容易造成定量不准确等一系列问题。因此，发展一种非PCR扩增的快速检测方法成为GMO检测所追求的目标。石墨烯纳米带(GrapheneNanoribbons,GNRs)是最近被发现的又一种新型碳质纳米材料，其结构介于一维碳纳米管和二维石墨烯纳米片之间，被认为是拉长的石墨带，具有准一维蜂窝构型单层带状结构，以及优异的性能，如导电性较好、材料容易制备、表面含有大量的含氧官能团而容易功能化等，研究者们已初步将其应用于电子学、光学、磁学、生物医学、催化、传感器等诸多领域。石墨烯材料自身具有荧光性能，能够通过荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)来有效猝灭其他分子的荧光，传统的荧光能量转移速率由供体与受体距离(d)的负6次方决定，而石墨烯材料与荧光分子的荧光能量转移速率取决于d的负4次方，荧光淬灭效率更高。但是，石墨烯纳米片之间由于存在强烈的相互作用，易于重新堆砌成石墨，这给石墨烯的应用研究造成严重的障碍。通过选择合适的功能材料与其杂化，形成石墨烯杂化材料，不仅可以有效地阻止石墨烯纳米片的重新聚集，而且所制备的石墨烯杂化材料还可能会被赋予更加优异的物理化学性能[153]。最近的研究发现，通过将碳纳米管与石墨烯进行复合，所得到的MWCNTs/GONRs，不仅可以保持碳纳米管良好的机械性能，而且可以有效增加石墨烯纳米片的层间距使其不易团聚，具有良好的分散性。量子点是一种新型荧光纳米材料，相对于传统有机荧光染料分子，量子点的发射光谱窄而且不拖尾，因而，以量子点为给体的荧光共振能量转移，可减少给体与受体发射光谱的重叠；量子点的激发光谱范围较宽，当它作为能量给体时，可以更自由地选择激发波长，从而最大限度地避免对受体的直接激发；量子点的发射光谱可调，也就是说它可以为吸收光谱在可见区的任一生色团作能量给体。所以，量子点应用于荧光共振能量转移的研究，已受到广大科研工作者的广泛关注。由于具有良好的化学惰性、生物相容性和较低的生物毒性，在生物成像、疾病检测、药物输送和光电器件应用领域中引起了极大关注。而碲化镉量子点(CdTeQDs)可通过控制反应时间，得到不同的荧光颜色，可实现单一检测溶液中多种目标物的同时检测。绿色CdTeQDs(记作：gQDs)和红色CdTeQDs(记作：rQDs)同时作为FRET中的能量供体，而MWCNTs/GONRs作为FRET传感器的受体。终止子的探针(记作：NP)和启动子的探针(记作：PP)末端修饰氨基，分别与gQDs)和rQDs的羧基通过酰胺反应，形成NP-gQDs和PP-rQDs；然后两者与MWCNTs/GONRs通过π-π叠加作用，使NP-gQDs和PP-rQDs吸附于MWCNTs/GONRs表面，淬灭QDs的荧光；当加入待检测目标DNA,即终止子NOS和启动子P35s后，目标DNA和NP-gQDs和PP-rQDs杂交互补配对，形成QDs-dsDNA,从而把NP-gQDs和PP-rQDs从MWCNTs/GONRs表面解离，从而使QDs的荧光恢复。
技术实现思路
本专利技术旨在专利技术一种多元、高灵敏度、高选择性、简单易操作等优点为一体的FRET方法，提供一种制备工艺简单，灵敏度高，测量范围宽，成本低的检测含有启动子P35s和终止子NOS的转基因作物及产品的方法，解决现有检测成本高、检测方案复杂、检测时间过长、灵敏度较低、检测目标单一的难题。多元转基因元件检测的荧光共振能量转移传感器的制备方法：发出荧光信号的QDs通过酰胺反应和捕获探针结合，形成QDs-探针；通过探针与MWCNTs/GONRs的π-π叠加作用，使QDs-探针吸附于MWCNTs/GONRs表面，淬灭QDs的荧光；当加入待检测目标DNA，即终止子NOS和启动子P35s后，终止子NOS和启动子P35s分别和捕获探针杂交互补配对，形成QDs-双链DNA,从而把QDs-探针从MWCNTs/GONRs表面解离，从而使QDs的荧光恢复。通过所恢复的荧光强度的测定，检测转基因大豆中是否含有终止子NOS和启动子P35s以区分转基因和非转基因大豆。本专利技术是通过如下技术方案实现的：多种转基因元件同时快速检测的方法，包括如下步骤：步骤1、多壁碳纳米管/氧化石墨烯纳米带MWCNTs/GONRs分散液的制备；步骤2、绿色碲化镉量子点溶液和红色碲化镉量子点溶液的制备；步骤3、碲化镉量子点-捕获探针分散液的制备：取步骤2制备的绿色碲化镉量子点溶液和红色碲化镉量子点溶液超声分散，采用HCl调节绿色碲化镉量子点溶液的pH值，得到混合液A；采用HCl调节红色碲化镉量子点溶液的pH值，得到混合液B；向混合液A中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，振荡均匀，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，振荡均匀，加入终止子的探针(NP)，在室温下反应，得到绿色碲化镉量子点-捕获探针，记作NP-gQDs；向混合液B中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液，振荡均匀，加入N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液，振荡均匀，加入启动子的探针(PP)；在室温下反应，得到红色碲化镉量子点-捕获探针，记作PP-rQDs；之后用乙醇洗涤，离心，最后将NP-gQDs和PP-rQDs分别分散于Tris-HCl缓冲液中，分别得到NP-gQDs分散液和PP-rQDs分散液，备用；步骤4、荧光共振能量转移传感体系的构建：将MWCNTs/GONRs分散液与NP-gQDs溶液和PP-rQDs溶液混合，超声分散，得到混合液，静置后，测定其荧光强度；步骤5、标准曲线的构建：将不同浓度的终止子NOS溶液和启动子P35s溶液加入到步骤4所得的混合液中，超声，静置后，测量其荧光恢复程度，构建标准曲线；步骤6、基于荧光共振能量转移传感体系对转基因大豆的检测：采用植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆的DNA溶液，之后将转基因大豆的DNA加入到步骤4构建的荧光共振能量转移传感体系中，测定其荧光恢复强度与标准曲线进行对比本文档来自技高网...

【技术保护点】
多种转基因元件同时快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、多壁碳纳米管/氧化石墨烯纳米带MWCNTs/GONRs分散液的制备；步骤2、绿色碲化镉量子点溶液和红色碲化镉量子点溶液的制备；步骤3、碲化镉量子点‑捕获探针分散液的制备：取步骤2制备的绿色碲化镉量子点溶液和红色碲化镉量子点溶液超声分散，采用HCl调节绿色碲化镉量子点溶液的pH值，得到混合液A；采用HCl调节红色碲化镉量子点溶液的pH值，得到混合液B；向混合液A中加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，振荡均匀，加入N‑羟基琥珀酰亚胺溶液，振荡均匀，加入终止子的探针，在室温下反应，得到绿色碲化镉量子点‑捕获探针，记作NP‑gQDs；向混合液B中加入1‑(3‑二甲氨基丙基)‑3‑乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，振荡均匀，加入N‑羟基琥珀酰亚胺溶液，振荡均匀，加入启动子的探针；在室温下反应，得到红色碲化镉量子点‑捕获探针，记作PP‑rQDs；之后用乙醇洗涤，离心，最后将NP‑gQDs和PP‑rQDs分别分散于Tris‑HCl缓冲液中，分别得到NP‑gQDs分散液和PP‑rQDs分散液，备用；步骤4、荧光共振能量转移传感体系的构建：将MWCNTs/GONRs分散液与NP‑gQDs溶液和PP‑rQDs溶液混合，超声分散，得到混合液，静置后，测定其荧光强度；步骤5、标准曲线的构建：将不同浓度的终止子NOS溶液和启动子P35s溶液加入到步骤4所得的混合液中，超声，静置后，测量其荧光恢复程度，构建标准曲线；步骤6、基于荧光共振能量转移传感体系对转基因大豆的检测：采用植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆的DNA溶液，之后将转基因大豆的DNA加入到步骤4构建的荧光共振能量转移传感体系中，测定其荧光恢复强度与标准曲线进行对比，得出是否含有NOS和P35s的结论。...

【技术特征摘要】
1.多种转基因元件同时快速检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1、多壁碳纳米管/氧化石墨烯纳米带MWCNTs/GONRs分散液的制备；步骤2、绿色碲化镉量子点溶液和红色碲化镉量子点溶液的制备；步骤3、碲化镉量子点-捕获探针分散液的制备：取步骤2制备的绿色碲化镉量子点溶液和红色碲化镉量子点溶液超声分散，采用HCl调节绿色碲化镉量子点溶液的pH值，得到混合液A；采用HCl调节红色碲化镉量子点溶液的pH值，得到混合液B；向混合液A中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，振荡均匀，加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液，振荡均匀，加入终止子的探针，在室温下反应，得到绿色碲化镉量子点-捕获探针，记作NP-gQDs；向混合液B中加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液，振荡均匀，加入N-羟基琥珀酰亚胺溶液，振荡均匀，加入启动子的探针；在室温下反应，得到红色碲化镉量子点-捕获探针，记作PP-rQDs；之后用乙醇洗涤，离心，最后将NP-gQDs和PP-rQDs分别分散于Tris-HCl缓冲液中，分别得到NP-gQDs分散液和PP-rQDs分散液，备用；步骤4、荧光共振能量转移传感体系的构建：将MWCNTs/GONRs分散液与NP-gQDs溶液和PP-rQDs溶液混合，超声分散，得到混合液，静置后，测定其荧光强度；步骤5、标准曲线的构建：将不同浓度的终止子NOS溶液和启动子P35s溶液加入到步骤4所得的混合液中，超声，静置后，测量其荧光恢复程度，构建标准曲线；步骤6、基于荧光共振能量转移传感体系对转基因大豆的检测：采用植物DNA提取试剂盒提取转基因大豆的DNA溶液，之后将转基因大豆的DNA加入到步骤4构建的荧光共振能量转移传感体系中，测定其荧光恢复强度与标准曲线进行对比，得出是否含有NOS和P35s的结论。2.根据权利要求1所述的多种转基因元件同时快速检测的方法，其特征在于，步骤3中，制备NP-gQDs时，所使用的绿色碲化镉量子点溶液、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶液、N-羟基琥珀酰亚胺溶液与捕获探针储备液的体积比为42:2:2:1；制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：李雅琪，王坤，蔡健荣，孙力，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32