本发明专利技术提供使用含有海藻糖的细胞洗涤溶液的贴壁细胞的洗涤方法，所述方法能有效抑制由为了从培养容器剥离贴壁细胞而进行的蛋白质分解酶处理及之后的细胞处理导致的细胞死亡，还提供用于所述洗涤方法的细胞洗涤液、使用了上述细胞洗涤液的移植用细胞悬浮液的制造方法、含有上述细胞洗涤液的试剂盒。本发明专利技术通过下述解决手段可以抑制(阻止)由蛋白质分解酶处理导致的细胞死亡(凋亡等)：向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它们的盐，制作含有海藻糖或其衍生物或它们的盐作为有效成分的细胞洗涤液，使用所述细胞洗涤液，在通过蛋白质分解酶处理从培养容器剥离贴壁细胞之前洗涤细胞。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术提供，所述方法能有效抑制由为了从培养容器剥离贴壁细胞而进行的蛋白质分解酶处理及之后的细胞处理导致的细胞死亡，还提供用于所述洗涤方法的细胞洗涤液、使用了上述细胞洗涤液的移植用细胞悬浮液的制造方法、含有上述细胞洗涤液的试剂盒。本专利技术通过下述解决手段可以抑制(阻止)由蛋白质分解酶处理导致的细胞死亡(凋亡等)：向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它们的盐，制作含有海藻糖或其衍生物或它们的盐作为有效成分的细胞洗涤液，使用所述细胞洗涤液，在通过蛋白质分解酶处理从培养容器剥离贴壁细胞之前洗涤细胞。【专利说明】
本专利技术涉及贴壁细胞的洗涤方法，其特征在于，在通过蛋白质分解酶处理从培养容器剥离贴壁细胞之前，使用向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它们的盐而成的细胞洗涤液，洗涤贴壁细胞，本专利技术还涉及用于所述洗涤方法的上述细胞洗涤液、使用了上述细胞洗涤液的移植用细胞悬浮液的制造方法、含有上述细胞洗涤液的用于制造移植用细胞悬浮液的试剂盒等。
技术介绍
近年来，由于干细胞研究的急速发展，对再生医疗的热忱高涨，其知识和理解不限于研究人员，已开始一般性地广泛普及。使用干细胞的再生医疗是以利用干细胞具有的自我复制能力和多分化潜能或利用干细胞分泌的因子、使因各种疾病受到损伤的细胞和组织的功能恢复为目的的医疗。如果对白血病、再生障碍性贫血等的血液疑难病的患者进行骨髓移植，则造血干细胞植活于患者体内，能在几乎一生中维持造血能力。另外，最近很多研究人员以使用了造血干细胞以外的干细胞的临床应用为目标，鉴定中枢神经、末梢神经、骨髓、小肠等中的干细胞，开始实践针对外伤性疾病、组织变性疾病的组织干细胞的移植治疗(非专利文献I~3)。因为能从生物体内采集的用于移植治疗的干细胞的量极少，所以一般要将采集的干细胞在体外进行传代培养来使其增殖（专利文献I)。传代培养的过程中，从培养容器剥离干细胞时，一般使用胰蛋白酶等蛋白质分解酶，但存在下述问题：由蛋白质分解酶处理导致细胞受到损伤，以致细胞死亡的情况以一定比例发生。为了实施高质量的再生医疗，必须提供充足量（数目）的干细胞，同时提供高质量的细胞、即存活细胞比例高的干细胞（群）是重要的，因此开发能抑制传代培养时由蛋白质分解酶处理导致的细胞死亡的方法成为当务之急。另一方面，海藻 糖（trehalose)是葡萄糖以1，I-糖苷键键合得到的一种二糖。海藻糖呈甜味，具有高保水力，因此用于各种食品和化妆品。另外，海藻糖具有稳定细胞膜、抑制细胞损伤的性质，因此，在器官移植时作为器官保护液的有效成分使用。开发了 ET-Kyoto液和New ET-Kyoto液等含有海藻糖的优秀的器官保存液（专利文献2和3、非专利文献4)。但是，在通过胰蛋白酶等蛋白质分解酶从培养容器剥离细胞之前，用含有海藻糖的生理性水溶液洗涤贴壁细胞的情况下，是否能抑制由蛋白质分解酶处理导致的细胞死亡是未知的。专利文献I :美国专利第5486359号专利文献2 :日本专利第3253131号公报专利文献3 :国际公开第2007/043698号说明书非专利文献I ：Gage, F. H. Science287 :1433-1438 (2000)非专利文献2 ：Morrison, S. J.等人，Cell96 :737-749 (1999)非专利文献3 :Batle，Ε·等人，Celllll :251-263 (2002)非专利文献 4 ：Chem, F.等人，Yonsei Med. J. 45 :1107-1114 (2004)
技术实现思路
本专利技术的课题是提供贴壁细胞的洗涤方法，所述方法能有效抑制由为了从培养容器剥离贴壁细胞而进行的蛋白质分解酶处理及之后的细胞处理导致的细胞死亡，以及提供用于所述洗涤方法的细胞洗涤液、使用了上述细胞洗涤液的移植用细胞悬浮液的制造方法、含有上述细胞洗涤液的试剂盒。本专利技术人等发现，用含有海藻糖的生理性水溶液对通过蛋白质分解酶处理从细胞培养容器剥离的间充质干细胞进行洗涤时，间充质干细胞的细胞死亡得到抑制（日本专利申请2011-072068)。由蛋白质分解酶处理导致细胞受到损伤时，细胞死亡（凋亡等）的途径被诱导，因此认为所述由海藻糖带来的效果是由于抑制了凋亡途径或促进了细胞损伤的修复功能而产生的，但在为了解决上述课题进行的反复深入研究中，偶然地在蛋白质分解酶处理前用含有海藻糖的乳酸林格液（Lactate Ringer’s solution ;以下简称为“LRT”）洗涤细胞，结果发现，与使用对照的乳酸林格液（以下简称为“LR”）或磷酸缓冲生理盐水(Phosphate buffered saline ;PBS)的情况、或在蛋白质分解酶处理后用LRT洗漆细胞的情况等相比，更能有效抑制细胞死亡，由此完成了本专利技术。gp，本专利技术涉及：项⑴一种贴壁细胞的洗涤方法，其特征在于，在通过蛋白质分解酶处理从培养容器剥离贴壁细胞之前，使用下述细胞洗涤液洗涤贴壁细胞，所述细胞洗涤液是向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它们的盐而成的。项（2)上述项（I)所述的方法，其特征在于，贴壁细胞是间充质干细胞。项（3)上述项⑴或⑵所述的方法，其特征在于，细胞洗涤液中的海藻糖或其衍生物或它们的盐的浓度为I ~15 (w/v) %。另外，本专利技术涉及：项（4) 一种细胞洗涤液，用于在通过蛋白质分解酶处理从培养容器剥离贴壁细胞之前洗涤贴壁细胞，其特征在于，所述细胞洗涤液是向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它们的盐而成的。项（5)上述项（4)所述的细胞洗涤液，其特征在于，贴壁细胞是间充质干细胞。项（6)上述项（4)或（5)所述的细胞洗涤液，其特征在于，海藻糖或其衍生物或它们的盐的浓度为I~15 (w/v) %。另外，本专利技术涉及：项（7) —种移植用细胞悬浮液的制造方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤(a)~（d)：步骤（a):除去贴壁细胞贴附的培养容器中的培养基，用向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它们的盐而成的细胞洗涤液洗涤贴壁细胞；步骤（b):通过蛋白质分解酶处理使得贴壁细胞从培养容器剥离；步骤（C):将从培养容器剥离的贴壁细胞悬浮于含有蛋白质的生理性水溶液中，制成细胞悬浮液；步骤（d):除去细胞悬浮液中的溶液，用生理性水溶液洗涤贴壁细胞。项（8)上述项（7)所述的制造方法，其特征在于，贴壁细胞是间充质干细胞。项（9)上述项（7)或（8)所述的制造方法，其特征在于，步骤（a)中的细胞洗涤液中的海藻糖或其衍生物或它们的盐的浓度为I~15 (w/v) %。项（10)上述项（7)~（9)中任一项所述的制造方法，其特征在于，步骤（b)中的蛋白质分解酶为胰蛋白酶。项（11)上述项（7)~（10)中任一项所述的制造方法，其中，步骤（C)中的含有蛋白质的生理性水溶液还含有海藻糖或其衍生物或它们的盐。项（12)上述项（7)~（11)中任一项所述的制造方法，其特征在于，步骤（C)中的含有蛋白质的生理性水溶液为含有血清的动物细胞培养用基础培养基。项（13)上述项（7)~（12)中任一项所述的制造方法，其特征在于，步骤（d)中的生理性水溶液还含有海藻糖或其衍生物或它们的盐。另外，本专利技术涉及：项（14) 一种试剂盒，用于制造移植用细胞悬浮液，其特征在本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种贴壁细胞的洗涤方法，其特征在于，在通过蛋白质分解酶处理从培养容器剥离贴壁细胞之前，使用下述细胞洗涤液洗涤贴壁细胞，所述细胞洗涤液是向生理性水溶液中添加海藻糖或其衍生物或它们的盐而成的。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：小林英司，和田圭树，土居雅子，
申请(专利权)人：株式会社大塚制药工场，
类型：发明
国别省市：日本;JP
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