诊断性肽的检测制造技术

对源自血液的样品中的SOCS-2、α1抗胰蛋白酶、多功能蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖、层粘连蛋白或其他蛋白的瓜氨酸化片段进行检测显示了与类风湿性关节炎或纤维化疾病相关的诊断意义，所述片段具有包含瓜氨酸的末端抗体结合位点类风湿性关节炎。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】诊断性肽的检测本专利技术涉及循环中瓜氨酸化(citrullinated)肽的测定，并且本专利技术对于产生针对多种生理状况和疾病有诊断价值的信息来说是有意义的。将精氨酸修饰成瓜氨酸是由PAD酶(肽酰基精氨酸脱亚胺酶)的存在促进的翻译后修饰。瓜氨酸的存在和对精氨酸的修饰在RA患者中尤其重要，其原因是，已经发现大量的自身抗体是瓜氨酸特异性的。与常见的RA标志物例如类风湿因子相比，这些抗体具有提高的特异性和敏感性。尽管没有足够的证据，但是认为针对胶原蛋白和其他蛋白的自身免疫可能与RA的发病相关，因此，跟踪该自身免疫路径(自身抗原)可导致发现该疾病发病机理的更多证据。瓜氨酸化可以作为降解的标志物，其原因是，在凋亡小体中经常可以发现瓜氨酸化。尽管在类风湿性关节炎的实验室诊断和监测中，检测针对人瓜氨酸化肽、尤其是环瓜氨酸化肽(抗CCP抗体)的抗体是标准测试，但是很少有研究关注对人血清或血浆中瓜氨酸化蛋白定量的临床应用。Takizawa和其同事(Takizawa等,2006)研究了人体液中瓜氨酸化自身抗原的存在。在ELISA中采用两种分别针对合成肽R16Cit (EGGGVR*GPRVV)和R252Cit(GNEITR*GGSTS)的单克隆抗体，即cF16.1和cF252.1，所述合成肽来源于纤维蛋白原(R*表示精氨酸被瓜氨酸取代)，所述两种抗体用作ELISA中的包被抗体以检测瓜氨酸化纤维蛋白原。并未报道所述两种单克隆抗体的确切表位特异性。在针对来自类风湿性关节炎患者之滑液的ELISA中检测到阳性信号，但是所有RA(包括对照)血浆样本仍为阴性，Takizawa得出结论认为纤维蛋白原在血液中是非瓜氨酸化的。之后的另一针对RA患者的研究证实了循环中缺乏瓜氨酸化纤维蛋白原(VanSteendam等，2010)，其报道了含有纤维蛋白原-β和纤连蛋白的循环中免疫复合物，但是其仅仅是非瓜氨酸化的形式。相反，在来自RA患者滑液的免疫复合物中检测到了瓜氨酸化波形蛋白(vimentin)和少量的纤维蛋白原-β。Chang及其同事(Chang等，2005)报道了在RA患者血浆中存在瓜氨酸化的纤连蛋白。尽管没有对其含量进行定量，但是据报道，与健康对照和患有系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)的患者相比，在RA血衆中所述水平更高。他们采用了夹心式ELISA，其利用结合人纤连蛋白的单克隆抗体(Abcam)作为包被抗体，以及利用抗瓜氨酸兔抗体(Biogenesis)作为检测抗体。并未提供对所述夹心式测定所检测的纤连蛋白分子的表征。然而，检测中采用的抗体无法用于对特定蛋白水解的、瓜氨酸化的纤连蛋白新表位进行定量，这是因为它们既不能与完整的瓜氨酸化纤连蛋白区分开来，也不能与具有在包被抗体所识别的肝素结合域中之表位的瓜氨酸化纤连蛋白片段区分开来。此外，Zhao及其同事(Zhao等，2008)报道了来自RA血浆的高分子量免疫复合物中瓜氨酸化纤维蛋白原的存在。简单地说，对获得自RA血浆样品的免疫复合物进行分级分离后，采用针对免疫印迹的抗瓜氨酸检测试剂盒(Upstate, Chicago, IL, USA)检测到瓜氨酸化纤维蛋白原的存在。在来自健康对照血浆的对应免疫印迹中缺乏此条带。Tilleman等(2008)报道了在获得自炎性关节炎(主要是类风湿性关节炎)患者的滑液胞浆蛋白提取物中存在瓜氨酸化波形蛋白的片段。通过质谱，在RA患者的滑液中检测出了瓜氨酸化纤维蛋白原、瓜氨酸化纤连蛋白和瓜氨酸化波形蛋白(Tabushi等，2008)在其他疾病的患者中也发现了 RA中的大部分自身抗体，因此，其具有有限的诊断意义。然而，已经记载了某些(相对地)特异性自身抗原，尤其是携带瓜氨酸化残基的自身抗原，它们包括:瓜氨酸化聚丝蛋白(filaggrin)、瓜氨酸化波形蛋白和环形瓜氨酸化肽(Van Galen 等，2005 ；Schellekenes 等，1998)。Lundgren等(2005)提出瓜氨酸化II型胶原蛋白可能具有显著的致关节炎能力。之后的报道证实了，在RA患者滑液中存在瓜氨酸化三螺旋II型胶原蛋白表位(Uysal等，2009)，认为针对(天然的和瓜氨酸化的)II型胶原蛋白的自身免疫是RA致病的重要因素。采用针对天然II型胶原蛋白的单克隆抗体作为捕获抗体，采用结合瓜氨酸化II型胶原蛋白的单克隆抗体ACC2作为检测抗体，来检测滑液中的瓜氨酸化II型胶原蛋白。后一抗体与瓜氨酸化纤维蛋白原交叉反应(Uysal等,2009)。有报道称在去除蛋白(cbpiOteinisation)并用高效液相色谱(HPLC)定量之后对循环中瓜氨酸水平进行定量是小肠上皮细胞辐射损伤的生理标志物(Lutgens等，2003)。我们目前已经确定，采用对以下表位具有特异性的抗体可以检测出血液或其液体组分例如血浆中的瓜氨酸化肽，所述表位为将瓜氨酸的存在与所述肽的末端氨基酸序列相组合。我们假设，当瓜氨酸位于蛋白片段的末端或者接近末端时，蛋白片段优先存留于血液循环中。采用对特定氨基 酸序列中的瓜氨酸具有特异性的抗体，可以检测出以所述氨基酸序列所来源的特定蛋白之片段的形式而来的肽。这可能是因为，瓜氨酸化赋予了改变的对由多种蛋白酶所导致的降解的抵抗力。对这些肽的定量可以获得与多种疾病状态相关的诊断信息，在所述疾病状态中，相关蛋白的产生和/或降解发生改变。因此，本专利技术提供了一种对包含血液或其液体组分的样品中蛋白的瓜氨酸化片段的测定方法，包括将所述样品与对所述蛋白的瓜氨酸化片段具有特异性结合亲和力的抗体或其片段接触，所述片段具有包含瓜氨酸的末端抗体结合位点，从而抗体片段的抗体的结合要求所述结合位点中同时存在特定末端氨基酸序列和所述瓜氨酸，以及检测所述抗体与所述蛋白质片段的结合。瓜氨酸可以在所述序列的最末端位置，这可是是抗体结合所需的。所述表位的位置可以是N末端或者C末端。优选地，所述抗体所需的氨基酸序列是对所述蛋白质特异性的。优选地，所述抗体或其片段对波形蛋白的瓜氨酸化片段具有特异性结合亲和力，所述片段具有包含瓜氨酸的末端抗体结合位点，从而抗体片段的抗体的结合要求存在包含瓜氨酸的末端波形蛋白氨基酸序列，以及检测所述抗体与所述波形蛋白片段的结合。优选地，所述抗体或其片段对S0CS-2、α?抗胰蛋白酶、多功能蛋白聚糖(versican)、双糖链蛋白聚糖(biglycan)或层粘连蛋白(Iaminin)的瓜氨酸化片段具有特异性结合亲和力，上述片段具有包含瓜氨酸的末端抗体结合位点，从而抗体片段的抗体的结合要求存在包含瓜氨酸的、对所述蛋白具有特异性的末端氨基酸序列，以及检测所述抗体与所述片段的结合。或者，所述抗体或其片段对弹性蛋白或V型和VI型胶原蛋白的瓜氨酸化片段具有特异性结合亲和力，所述片段具有包含瓜氨酸的末端抗体结合位点，从而抗体片段的抗体的结合要求存在含有瓜氨酸的、对所述蛋白具有特异性的末端氨基酸序列，以及检测所述抗体与所述片段的结合。所述结合的检测优选是定量的。典型地，将结合的量与对照值相比较，所述对照值的建立是针对健康个体和以纤维化疾病或类风湿性关节炎为特征的个体的群体。所述方法可以以竞争性测定的形式进行，从而所述样品中的肽与已知浓度的结合试剂竞争结合本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种对包含血液或其液体组分的样品中蛋白质的瓜氨酸化片段进行测定的方法，所述方法包括将所述样品与抗体或其片段相接触，所述抗体或其片段对所述蛋白质的瓜氨酸化片段具有特异性结合亲和力，所述瓜氨酸化片段具有包含瓜氨酸的末端抗体结合位点，从而抗体片段的抗体的结合要求在所述结合位点中同时存在特定的末端氨基酸序列和所述瓜氨酸，以及检测所述抗体与所述蛋白质片段的结合。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.05.27 GB 1108970.3;2011.07.05 GB 1111469.11.一种对包含血液或其液体组分的样品中蛋白质的瓜氨酸化片段进行测定的方法，所述方法包括将所述样品与抗体或其片段相接触，所述抗体或其片段对所述蛋白质的瓜氨酸化片段具有特异性结合亲和力，所述瓜氨酸化片段具有包含瓜氨酸的末端抗体结合位点，从而抗体片段的抗体的结合要求在所述结合位点中同时存在特定的末端氨基酸序列和所述瓜氨酸，以及检测所述抗体与所述蛋白质片段的结合。2.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其片段对波形蛋白的瓜氨酸化片段具有特异性结合亲和力，所述瓜氨酸化片段具有包含瓜氨酸的末端抗体结合位点，从而抗体片段的抗体的结合要求存在含有瓜氨酸的末端波形蛋白氨基酸序列，以及检测所述抗体与所述波形蛋白片段的结合。3.如权利要求1所述的方法，其中所述抗体或其片段对S0CS-2、αI抗胰蛋白酶、多功能蛋白聚糖、双糖链蛋白聚糖或层粘连蛋白的瓜氨酸化片段具有特异性结合亲和力，所述瓜氨酸化片段具有包含瓜氨酸的末端抗体结合位点，从而抗体片段的抗体的结合要求存在包含瓜氨酸的来自所述蛋白质的...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴安娜·朱利·利明，莫滕·卡尔斯达尔，埃夫斯塔西奥斯·瓦西利亚迪斯，
申请(专利权)人：北欧生物科技公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK