采用真菌过氧化酶的脂族烃的区域选择性氧化制造技术

本发明专利技术涉及在取代或未取代的、直链或支链的脂族烃的两端的2或3位进行羟基化的酶法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】采用真菌过氧化酶的脂族烃的区域选择性氧化序列表的参省本申请包含计算机可读形式的序列表。该计算机可读形式并入本文以供参考。
本专利技术涉及具有过氧化酶(peroxygenase)活性的多肽在脂族烃的位点特异性氧化中的用途。
技术介绍
发现来自伞菌类担子菌菌株茶树燕(Agrocybe aegerita)(菌株TM-A1)的表示为AaP的过氧化酶使芳基醇和醛氧化。通过数个步骤的离子色谱和SDS-PAGE从茶树菇TM A1中纯化AaP过氧化酶，在2D电泳之后确定分子量和N端14氨基酸序列，但未分离编码基因(Ullrich 等人，2004，Appl.Env.Microbiol.70 (8):4575-4581)。W02006/034702公开使用茶树菇TM A1的AaP过氧化酶对未活化的烃诸如萘、甲苯和环己烷进行酶羟化的方法。这也描述于U1 lrich和Hofrichter，2005, FEBSLetters579:6247-6250。W02008/119780公开来自茶树燕、灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)、双色腊蘑(Laccaria bicolor)和辅毛鬼伞(Coprinus radians)的八种不同的过氧化酶；在本申请中还示为 SEQ ID N0s:l-8。DE10332065A1公开通过使用茶树菇TM A1的AaP过氧化酶由醇通过中间形成醛而酶法制备酸的方法。`报道了迅速且选择性分光光度法直接检测经AaP过氧化酶的芳族羟化的方法(Kluge 等人，2007, Appl Microbiol Biotechnol75:1473-1478)。众所周知将氧官能团直接区域选择性引入有机分子(氧合)在化学合成中构成问题。特别难以催化脂族烃的选择性羟化。产物可在各种不同合成中用作重要的中间体。具体而言，烷烃的化学羟化相对较复杂，需要强力的/毒性的化学品/催化剂，并导致一系列不期望的副产物。已知一种胞内酶甲烷单加氧酶(ΜΜ0，EC14.13.25)，使一些烃的末端碳氧合/羟化。ΜΜ0酶由数个蛋白质组分组成，并由甲基营养菌(例如荚膜甲基球菌(Methylococcuscapsulatus))形成；其需要复合电子供体诸如NADH或NADPH、辅助蛋白(黄素还原酶、调节蛋白)和分子氧(02)。ΜΜ0的天然底物是甲烷，其被氧化为甲醇。作为特别非特异性的生物催化剂，除甲烷之外，ΜΜ0还氧合/羟化一系列进一步的底物诸如正烷烃及其衍生物、环烷烃、芳族化合物、一氧化碳和杂环化合物。该酶在生物技术中的应用目前尚不可能，因为其像大部分胞内酶一样难以分离，其具有低稳定性，且所需的共底物相对昂贵。
技术实现思路
在第一方面，本专利技术的专利技术人提供在取代或未取代的、直链或支链的脂族烃的至少两端的第二或第三碳处引入羟基或桥氧(0X0)基的酶法，该脂族烃具有至少5个碳并具有连接于所述第二或第三碳的氢，该方法包括使脂族烃与过氧化氢和具有过氧化酶活性的多肽接触，其中多肽包括:a)与 SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及b)由一种或多种以下基序所表示的氨基酸序列:基序I: [FL] XX [YF] S [AN] X [FHY] G [GN] GX [YF] N (SEQ ID NO: 9 );基序II:G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH] [LF]R (SEQ ID NO: 10);基序II1:RXXRI[QE] [DEQ]S[M]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序IV:S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；基序V:P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序V1:[TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)；基序VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD(SEQ ID NO: 15)。在其它方面，本专利技术提供具有过氧化酶活性的多肽用于从衣物中去除含脂质的污迹的用途；以及用于从衣物中减少不愉快气味的用途。【附图说明】图1示出用灰盖鬼伞过氧化酶(0.5mM H2O2)孵育的十四烷的色谱图；来自实施例3。图2示出用茶树菇过氧化酶(2.5mM H2O2)孵育的十四烷的色谱图；来自实施例3。图3示出用灰盖鬼伞过氧化酶(0.5mM H2O2)孵育的十四醇的色谱图；来自实施例4。图4示出用茶树菇过氧化酶(2.5mM H2O2)孵育的十四醇的色谱图；来自实施例4。【具体实施方式】过氧化酶活性:术语“过氧化酶活性”根据ECl.11.2.1在本文中定义为“非特异性过氧化酶”。这是血红素硫醇盐蛋白质(heme-thiolate protein)。该类型的酶包括由伞菌类担子菌分泌的糖蛋白。它们催化氧原子从H2O2插入广泛种类的底物，诸如萘、4-硝基苯并二氧杂环戍烯(4-nitrobenzodioxole);和烧烃诸如丙烷、己烧和环己烧。它们对于氯几乎无或无活性。为了本专利技术的目的，根据Kluge等人(2007，Appl MicrobiolBiotechnol75:1473-1478)描述的分光光度步骤确定过氧化酶活性。分离的多肽:本文使用的术语“分离的多肽”是指从来源分离的多肽。在优选的方面，通过SDS-PAGE确定，多肽为至少1%纯，优选至少5%纯，更优选至少10%纯，更优选至少20%纯，更优选至少40%纯，更优选至少60%纯，甚至更优选至少80%纯，并且最优选至少90%纯。基本上纯的多肽:术语“基本上纯的多肽”在本文表示多肽制品，其含有按重量计至多10%，优选至多8%，更优选至多6%，更优选至多5%，更优选至多4%，更优选至多3%，甚至更优选至多2%，最优选至多1%，并且甚至最优选至多0.5%的与其天然或重组相关的(associated)其它多肽材料。因此，优选基本上纯的多肽是按存在于制品中的全部多肽材料的重量计至少92%纯，优选至少94%纯，更优选至少95%纯，更优选至少96%纯，更优选至少96%纯，更优选至少97%纯，更优选至少98%纯，甚至更优选至少99%，最优选至少99.5%纯，并且甚至最优选100%纯。本专利技术的多肽优选是基本上纯的形式，即，该多肽制品基本上不含与其天然或重组相关的其它多肽材料。例如，这能够通过众所周知的重组方法或通过经典的纯化方法制备多肽来实现。成熟多肽:术语“成熟多肽”在本文中定义为具有过氧化酶活性的多肽，该多肽处于其在翻译和任何诸如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等的翻译后修饰之后的最终形式。在优选方面，成熟多肽具有基于N端肽测序数据(U1 Irich等人，2004, Appl.Env.Microbiol.70(8):: 4575-4581)(其阐明AaP过氧化酶的成熟蛋白质的开始)的SEQ ID NO:1的位置I至330中所示的氨基酸序列。在另一优选方面，成熟多肽具有SEQ ID NO:2中位置I至328中所示的氨基酸序列。同一性:两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“同一性”描述。为了本专利技术的目的，使用如本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在取代或未取代的、直链或支链的脂族烃的至少两端的第二或第三碳处引入羟基或酮基的方法，所述脂族烃具有至少5个碳并具有至少一个连接于所述第二或第三碳的氢，所述方法包括使所述脂族烃与过氧化氢和具有过氧化酶活性的多肽接触，其中所述多肽包括：a）与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及b）由一种或多种以下基序所表示的氨基酸序列：基序I：[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N （SEQ ID NO:9）；基序II：G[GN]GX[YF]NXX[VA]AX[EH][LF]R    （SEQ ID NO:10）；基序III：RXXRI[QE][DEQ]S[IM]ATN          （SEQ ID NO:11）；基序IV：S[IM]ATN[PG][EQN][FM][SDN][FL]   （SEQ ID NO:12）；基序V：P[PDK][DG]F[HFW]R[AP]             （SEQ ID NO:13）；基序VI：[TI]XXXLYPNP[TK][GV]             （SEQ ID NO:14）；基序VII：E[HG]DXSX[ST]RXD                （SEQ ID NO:15）。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.07.07 EP 11173073.51.一种在取代或未取代的、直链或支链的脂族烃的至少两端的第二或第三碳处引入羟基或酮基的方法，所述脂族烃具有至少5个碳并具有至少一个连接于所述第二或第三碳的氢，所述方法包括使所述脂族烃与过氧化氢和具有过氧化酶活性的多肽接触，其中所述多肽包括:a)与SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28 或 29具有至少30%同一性的氨基酸序列；以及b)由一种或多种以下基序所表示的氨基酸序列:基序 1:[FL]XX[YF]S[AN]X[FHY]G[GN]GX[YF]N (SEQ ID NO:9);基序 II:G [GN] GX [YF] NXX [VA] AX [EH] [LF] R (SEQ ID NO: 10)；基序 III:RXXRI [QE] [DEQ] S[IM]ATN(SEQ ID NO: 11)；基序 IV:S[IM]ATN[PG] [EQN] [FM] [SDN] [FL] (SEQ ID NO: 12)；基序 V:P[PDK] [DG]F[HFW]R[AP](SEQ ID NO: 13)；基序 VI: [TI]XXXLYPNP[TK] [GV](SEQ ID NO: 14)；基序 VI1:E[HG]DXSX[ST]RXD(SEQ ID N0:15)。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二或第三碳在与所述过氧化酶接触前是未取代的。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述多肽包括以下氨基酸序列或由以下氨基酸序列组成:与SEQ ID N0:l、2、3、4、5、6、7、8、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28或29的成熟多肽，优选SEQ ID NO: 2或4的成熟多肽，具有至少35%同一性，优选至少40...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·伦，J·布拉斯克，L·卡卢，A·古铁雷斯苏亚雷斯，E·D·巴博特，R·乌尔里希，M·霍弗里希特，A·T·马丁内斯费雷尔，J·C·德尔里奥安德拉德，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：丹麦;DK