低温乙醇提取静注人免疫球蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种低温乙醇提取静注人免疫球蛋白的方法，依次分离FⅠ、FⅡ+Ⅲ、FⅢ、FⅡ，在对FⅡ沉淀超滤、纯化时，依次采用超滤脱醇、巴氏灭活、一次沉淀分离、二次沉淀分离、二次沉淀超滤脱醇的工艺。本发明专利技术在过滤时将压滤机的温度控制在较低范围内，在沉淀分离工艺采用了适当的电导率，提高了免疫球蛋白的收率，在对免疫球蛋白纯化精制时，进行了两次沉淀分离，两次沉淀分离均采用了二级澄清除菌过滤，通过四级过滤技术，去除了制品中的不溶性颗粒，提高了制品的澄清度和收率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及以人血浆为原料制备静注人免疫球蛋白的方法，更具体的说涉及一种采用低温乙醇法提取静注人免疫球蛋白的方法。
技术介绍
低温乙醇法是人血浆蛋白的制备方法之一，该方法是1940年由美国哈佛大学医学院的EdwinJ.Cohn教授专利技术的，因此又称为“孔氏法”。孔氏法最初用来分离牛血清白蛋白，随后应用于人血浆分离。低温乙醇法是以混合血浆为原料，逐级降低酸度(从PH7.0降到pH4.0)。提高乙醇浓度(从O升到40%)，同时降低温度(从2°C降到_2°C)，各种蛋白在不同的条件下以组分(粗制品)的形式分步从溶液中析出，并通过离心或者过滤分离出来。影响蛋白质沉淀反应因素主要有五个，即:PH值、温度、蛋白质浓度、离子强度和乙醇浓度。由于工艺参数选择不合理及分离方法不科学，导致了现有的低温乙醇法生产人免疫球蛋白收率较低且纯度低。专利号为201110030778.3的专利技术专利公开了 “一种生产静注人免疫球蛋白的方法”，该专利技术的主要工艺如下:以人血浆为原料，首先从血浆中分离出组分I + II +III，再从组分I +11+III沉淀分离组分I +III，再分离组分II，再用层析法纯化组分II，之后进行病毒灭活，灭活后配制静注人免疫球蛋白。该方法的组分分离周期略长、且纯度较低，人免疫球蛋白生广的收率还有待提闻。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种，在用人血浆为原料制备静注人免疫球蛋白时，以提高静注人免疫球蛋白的收率。本专利技术所述，包括以下步骤:步骤一、从人血浆中分离F I，得F I上清液；步骤二、从F I上清液中分离出F II + III沉淀；步骤三、从F II + III沉淀中分离F III沉淀，得FIII上清液；步骤四、从F III上清液中分离出F II沉淀；步骤五、F II沉淀超滤、纯化，包括以下步骤:①、超滤脱醇:取重量为上述F II沉淀8~10倍、温度为2~8°C注射用水将F II沉淀完全溶解，采用二级澄清除菌过滤，调节溶液PH值至4.30~4.70 ;②、巴氏灭活:将超滤脱醇后的溶液用注射用水调节蛋白质含量至17~33g/l，按60~120g/l加入甘氨 酸，调节pH值至1.10~7.50，在55~65°C的温度下加温9~11小时进行巴氏灭活后，降温至20~30°C ；③、一次沉淀分离:用注射用水调节巴氏灭活后的溶液，使溶液中蛋白质含量为5.0~15.0g/Ι，调节溶液pH值至6.70~7.20，控制温度至O~2°C，调节乙醇浓度至体积百分比18~20%，控制温度至2~6°C，调节溶液的电导率为1.20~1.50ms/cm，搅拌反应I~3小时,按每千克蛋白质0.08~0.12kg比例分别添加等量的珍珠岩和娃藻土,继续反应0.5~1.5小时后,用压滤机进行加压过滤,加压过滤时,选用孔径不超过0.9 μ m的深层滤板，控制压滤机温度至5°C以下，过滤分离出一次沉淀，得一次沉淀上清液；④、二次沉淀分离:将一次沉淀上清液温度控制至-1~_3°C，调节pH值至7.10~7.40，乙醇浓度至体积百分比24~26%，控制溶液温度至-6~_12°C，调节溶液的电导率为1.50-1.90ms/cm,搅拌反应I~3小时,用压滤机进行加压过滤,加压过滤时,选用孔径不超过0.9μ m的深层滤板，控制压滤机温度至-3°C以下，过滤分离出二次沉淀；⑤、二次沉淀超滤脱醇:取重量为上述二次沉淀5~10倍、温度为2~8°C的注射用水将二次沉淀完全溶解，采用二级澄清除菌过滤，同时调节PH值至3.40~3.80，超滤脱醇后再调节pH值至3.8~4.4。步骤六、将步骤五所得二次沉淀溶液按成品规格配制，使蛋白质含量不低于50g/1，加入麦芽糖，使麦芽糖含量为90~110g/l，加入聚山梨酯-80，使聚山梨酯-80含量不大于80 μ g/ml,调节pH值至3.8~4.4,实现制品配制后,进行除菌过滤分装。所述步骤一是将融合后的人血浆的温度控制在0.0~4.(TC之间，调节蛋白质浓度至40~65g/l，调节溶液的电导率为12.0~14.0ms/cm,调节pH值至6.80~7.30，调节乙醇浓度至体积百分比7.0~10.0%，控制温度至-1.0~-3.(TC，用压滤机进行加压过滤，加压过滤时选用孔径不超过0.9 μ m的深层滤板，控制压滤机温度至-1°C以下，过滤分离出F I沉淀，得F I上清液。所述步骤二是,调节F I上清液pH值至5.70~6.30、乙醇浓度至体积百分比18.0~22.0%，控制温度至-4.0~-6.(TC，按照每16Kg蛋白质添加0.5~1.5Kg的比例分别添加等量的珍珠岩和硅藻土，用压滤机进行加压过滤，加压过滤时，选用孔径不超过0.7 μ m的深层滤板，控制压滤机温度至-3V以下，过滤分离出F II + III沉淀。所述步骤三是，取重量为上述F II + III沉淀8~10倍、温度为2~8°C的注射用水将F II + III沉淀完全溶解，调节pH值至4.60~5.00，搅拌反应I~2小时后，再将溶液的pH值调节至5.00~5.40，再进行搅拌反应I~2小时，调节溶液电导率为1.20~1.50ms/cm,调节乙醇浓度至体积百分比13~15%,反应I~3小时，按每千克F II + III沉淀添加0.07~0.1kg的比例分别添加等量的珍珠岩和娃藻土,继续反应0.5~1.5小时,用压滤机进行加压过滤，加压过滤时，选用孔径不超过0.7 μ m的深层滤板，控制压滤机温度至-1°C以下，过滤分离出F III沉淀，取F III上清。所述步骤四是，调节FIII上清液电导率为6.50~8.50ms/cm、调节pH值至7.00~7.40、乙醇浓度至体积百分比24~26%、控制温度至-6.0~-12.(TC，搅拌反应I~3小时，用压滤机进行加压过滤，加压过滤时，选用孔径不超过0.9 μ m的深层滤板，控制压滤机温度至-3°C以下，过滤分离出F II沉淀。本专利技术所述，从人血浆中依次分离F 1、F II +IILFIILF II，使得提取组分沉淀精益细化，缩短了组分的分离周期，利于人血浆的综合利用。通过控制压滤机的温度避免了制品压滤过程升温而导致蛋白变性，同时在沉淀分离工艺采用了适当的电导率，·故提高了免疫球蛋白的收率，免疫球蛋白的收率可达到5.2g/I以上(现有技术免疫球蛋白的收率为4.8g/l)。在对免疫球蛋白纯化精制时，进行了两次沉淀分离，两次沉淀分离均采用了二级澄清除菌过滤，通过四级过滤，去除了制品中的不溶性颗粒，提高了制品的澄清度。在人免疫球蛋白超滤前后分别进行溶液的PH控制，减少和去除人免疫球蛋白中的抗补体活性，提高了人免疫球蛋白的有效性。表一:产品的主要质量指标本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种低温乙醇提取静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一、从人血浆中分离FⅠ，得FⅠ上清液；步骤二、从FⅠ上清液中分离出FⅡ+Ⅲ沉淀；步骤三、从FⅡ+Ⅲ沉淀中分离FⅢ沉淀，得FⅢ上清液；步骤四、从FⅢ上清液中分离出FⅡ沉淀；步骤五、FⅡ沉淀超滤、纯化，包括以下步骤：①、超滤脱醇：取重量为上述FⅡ沉淀8～10倍、温度为2～8℃注射用水将FⅡ沉淀完全溶解，采用二级澄清除菌过滤，调节溶液pH值至4.30～4.70；②、巴氏灭活：将超滤脱醇后的溶液用注射用水调节蛋白质含量至17～33g/l，按60～120g/l加入甘氨酸，调节pH值至7.10～7.50，在55～65℃的温度下加温9～11小时进行巴氏灭活后，降温至20～30℃；③、一次沉淀分离：用注射用水调节巴氏灭活后的溶液，使溶液中蛋白质含量为5.0～15.0g/l，调节溶液pH值至6.70～7.20，控制温度至0～2℃，调节乙醇浓度至体积百分比18～20%，控制温度至2～6℃，调节溶液的电导率为1.20～1.50ms/cm，搅拌反应1～3小时，按每千克蛋白质0.08～0.12kg比例分别添加等量的珍珠岩和硅藻土，继续反应0.5～1.5小时后，用压滤机进行加压过滤，加压过滤时，选用孔径不超过0.9μｍ的深层滤板，控制压滤机温度至5℃以下，过滤分离出一次沉淀，得一次沉淀上清液；④、二次沉淀分离：将一次沉淀上清液温度控制至?1～?3℃，调节pH值至7.10～7.40，乙醇浓度至体积百分比24～26%，控制溶液温度至?6～?12℃，调节溶液的电导率为1.50～1.90ms/cm，搅拌反应1～3小时，用压滤机进行加压过滤，加压过滤时，选用孔径不超过0.9μｍ的深层滤板，控制压滤机温度至?3℃以下，过滤分离出二次沉淀；⑤、二次沉淀超滤脱醇：取重量为上述二次沉淀5～10倍、温度为2～8℃的注射用水将二次沉淀完全溶解，采用二级澄清除菌过滤，同时调节pH值至3.40～3.80，超滤脱醇后再调节pH值至3.8～4.4。步骤六、将步骤五所得二次沉淀溶液按成品规格配制，使蛋白质含量不低于50g/l，加入麦芽糖，使麦芽糖含量为90～110g/l，加入聚山梨酯?80，使聚山梨酯?80含量不大于80μg/ml，调节pH值至3.8～4.4，实现制品配制后，进行除菌过滤分装。...

【技术特征摘要】
1.一种低温乙醇提取静注人免疫球蛋白的方法，其特征在于:包括以下步骤: 步骤一、从人血浆中分离F I，得F I上清液； 步骤二、从F I上清液中分离出F II +III沉淀； 步骤三、从F II + III沉淀中分离FIII沉淀，得FIII上清液； 步骤四、从FIII上清液中分离出F II沉淀； 步骤五、F II沉淀超滤、纯化，包括以下步骤: ①、超滤脱醇:取重量为上述FII沉淀8~10倍、温度为2~8°C注射用水将 F II沉淀完全溶解，采用二级澄清除菌过滤，调节溶液pH值至4.30~4.70 ; ②、巴氏灭活:将超滤脱醇后的溶液用注射用水调节蛋白质含量至17~33g/l，按60~120g/l加入甘氨酸，调节pH值至7.10~7.50，在55~65°C的温度下加温9~11小时进行巴氏灭活后，降温至20~30°C ； ③、一次沉淀分离:用注射用水调节巴氏灭活后的溶液，使溶液中蛋白质含量为5.0~15.0g/Ι，调节溶液pH值至6.70~7.20，控制温度至O~2°C，调节乙醇浓度至体积百分比18~20%，控制温度至2~6°C，调节溶液的电导率为1.20~1.50ms/cm，搅拌反应I~3小时，按每千克蛋白质0.08~0.12kg比例分别添加等量的珍珠岩和娃藻土,继续反应0.5~1.5小时后，用压滤机进行加压过滤，加压过滤时，选用孔径不超过0.9 μ m的深层滤板，控制压滤机温度至5°C以下`，过滤分离出一次沉淀，得一次沉淀上清液； ④、二次沉淀分离:将一次沉淀上清液温度控制至-1~_3°C，调节pH值至7.10~7.40，乙醇浓度至体积百分比24~26%，控制溶液温度至-6~_12°C，调节溶液的电导率为1.50~1.90ms/cm,搅拌反应I~3小时,用压滤机进行加压过滤,加压过滤时,选用孔径不超过0.9μ m的深层滤板，控制压滤机温度至-3°C以下，过滤分离出二次沉淀； ⑤、二次沉淀超滤脱醇:取重量为上述二次沉淀5~10倍、温度为2~8°C的注射用水将二次沉淀完全溶解，采用二级澄清除菌过滤，同时调节PH值至3.40~3.80，超滤脱醇后再调节pH值至3.8~4.4。 步骤六、将步骤五所得二次沉淀溶液按成品规格配制，使蛋白质含量不低于50g/l，加入麦芽糖，使麦芽糖含量为90~110g/l，加入聚山梨酯-80，使聚山梨酯-80含量不大于80 μ g/ml,...

【专利技术属性】
技术研发人员：安康，张宝献，张其昌，王猛，滕世超，郭心怡，
申请(专利权)人：华兰生物工程重庆有限公司，
类型：发明
国别省市：