一种基因工程技术领域的基于巨大芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶外源表达方法，将测序得到的谷氨酰胺合成酶基因序列通过引物序列扩增并连接到表达载体中得到重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。本发明专利技术克服现有技术中由于谷氨酰胺合成酶基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，应用基因工程菌表达本发明专利技术所述的谷氨酰胺合成酶基因序列，实现极大的提高该基因的表达量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及的是一种基因工程
的方法，具体是一种谷氨酰胺合成酶基因序列、含有该基因的重组载体、重组载体转化表达菌株以及利用该重组菌产生该基因的表达产物及其应用。
技术介绍
氮元素是生物体必需也是需求量最大的矿物元素，主要用于合成生物所必需的氨基酸和核苷酸及其其他含氮化合物。氮元素的利用在农业生产中占据非常重要的位置。我国目前已成为世界第一氮肥生产与消费国，其氮肥使用量仍呈逐年递增的态势。然而，目前氮肥利用率低且过量使用造成的环境污染问题已成为世界性难题。因此，如何降低氮肥的使用量，提高利用率便成为工作的重中之重。生物体对氮元素的同化是十分重要的生理过程，无机氮必须同化为谷氨酰胺形式的有机氮才能被生物体吸收利用。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)是氮同化途径的关键酶，它与谷氨酸合成酶共同作用，催化NH4+同化成谷氨酰胺，谷氨酰胺又在谷氨酸合成酶的催化下，将其酰胺转移到a-酮戊二酸上，从而生成两分子谷氨酸。谷氨酰胺在生物体含氮有机物的生物合成中作为氮供体，而外界无机氮也必须通过这个途径才能进入生物体内的氮循环。因此GS在生物体氮同化过程中起到十分重要的作用。土壤中含有十分丰富的细菌群体。细菌谷氨酰胺合成酶涵盖目前发现的三大类谷氨酰胺合成酶GS 1、GS II和GS III，且相比植物谷氨酰胺合成酶基因具有种类多、易克隆等优势。巨大芽孢杆(Bacilus megaterium)是一种常见的土壤细菌,其谷氨酰胺合成酶基因的克隆及功能鉴定对于鉴定氮高效基因并应用于逆境条件下土壤理化性质的改善具有重要意义。 【专利
技术实现思路
】本专利技术针对现有技术存在的上述不足，提出一种，克服现有技术中由于谷氨酰胺合成酶基因序列在天然的巨大芽孢杆菌中表达量非常低，严重限制使用效果，应用基因工程菌表达本专利技术所述的谷氨酰胺合成酶基因序列，实现极大的提闻该基因的表达量。本专利技术是通过以下技术方案实现的:本专利技术涉及一种谷氨酰胺合成酶基因序列Bm-Gln A，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示，其长度为1335个碱基对，编码444个氨基酸，分子量约为50.3KD。本专利技术涉及一种，将测序得到的谷氨酰胺合成酶基因序列(Bm-Gln A)通过引物序列扩增并连接到表达载体中得到重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。所述的测序是指:以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后将扩增产物进行电泳检测；并将扩增产物切胶回收后连接到pET-41a载体上进行测序。所述的PCR扩增采用的引物由:正向引物Gln A-F: 5’ -ATGGCAAAGTACACAAAAGAAGATA-3’，以及反向引物Gln A-R: 5' -TTAATAITGGCTCATGTAITGGTCAC-3’ 所组成。所述的引物序列扩增采用的引物为PCR扩增采用的引物的5’端分别设计了 EcoR I和Stu I酶切位点用于连接到表达载体，即:正向引物GlnA-Eco R 1-F: 5' -CGGAATTCATGGCAAAGTACACAAAAGAAGATA-3’，以及反向引物 Gln A-Stu 1-R:5’-AAGGCCTTTAATAITGGCTCATGTAITGGTCAC-3’ 组成。所述的表达载体为pET_41a质粒。所述的大肠杆菌为大肠杆菌BL21 (DE3)。所述的巨大芽孢杆菌NCT-2 (Bacilus megaterium),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址是北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学微生物研究所；保存日期为2011年3月21日，保藏编号为CGMCC N0.4698。所述的重组表达载体是指:重组表达质粒pET-41a-Bm_Nas A。所述的转基因重组菌是指:含有重组表达质粒pET-41a-Bm_Nas A的大肠杆菌 BL21(DE3)。本专利技术涉及上述转基因重组菌的应用，将其发酵后量产谷氨酰胺合成酶。所述的应用进一步是指:通过将`该重组菌进行液体发酵，通过加入IPTG的方式， 可以诱导其体内谷氨酰胺合成酶基因大量表达进而产生大量谷氨酰胺合成酶，再通过优化发酵条件及酶工程的方法，最终获得高纯度的谷氨酰胺合成酶。本专利技术涉及上述谷氨酰胺合成酶基因序列的应用，将其用于表达目的蛋白产物。 技术效果本专利技术与现有技术相比，通过构建重组表达菌株，实现了谷氨酰胺合成酶基因的外源表达，并显著提高表达量；本专利技术采用Western Blot技术，可以对表达蛋白进行灵敏检测，可检测低至l_5ng (最低可至IO-1OOpg)的表达蛋白。【附图说明】图1菌落PCR验证示意图。图2重组表达质粒酶切电泳示意图。图3重组菌诱导表达谷氨酰胺合成酶的SDS-PAGE示意图。图4重组菌诱导表达谷氨酰胺合成酶的Western Blot-His ? Tag示意图。【具体实施方式】下面对本专利技术的实施例作详细说明，本实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。实施例1巨大芽抱杆菌(Bacilusmegaterium)NCT-2 的培养巨大芽孢杆菌NCT-2分离自上海市崇明岛设施栽培12-15年的大棚，保藏编号为CGMCC N0.4698。将该菌接种于LB液体培养基中，32°C培养OD6tltl至1.5左右，离心收集菌体并提取细菌的基因组DNA。所述的LB液体培养基组分为:蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC110g，去离子水1L， PH6.8-7.2。LB固体培养基即为在LB液体培养基的基础上添加15_20g的琼脂。实施例2巨大芽孢杆菌谷氨酰胺合成酶基因(Bm-Gln A)序列验证根据全基因组测序结果，设计PCR引物:正向引物Gln A-F: 5’ -ATGGCAAAGTACACAAAAGAAGATA-3’反向引物Gln A-R: 5' -TTAATATTGGCTCATGTATTGGTCAC-3’以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板，用上述两对引物进行扩增。PCR条件为:95°C预变性3min ;94°C变性45s，53。。退火30s，72。。延伸Imin ；30个循环后72°C终延伸 IOmin0将PCR扩增产物进行电泳检测，结果表明获得片段约为1.3Kb(见图1);然后将 PCR产物切胶回收后连接到pET-41a载体后送公司测序。经测序后得到的核昔酸序列与基因组测序结果相吻合，即为本专利技术序列表中 SEQ ID N0.1实施例3重组表达载体的构建根据测序得到的谷氨酰胺合成酶序列(Bm-Gln A)，设计引物扩增该基因并连接到 pET-41a表达载体上，然后倒入大肠杆菌BL21 (DE3)进行诱导表达。设计引物如下:正向引物GlnA-Eco R 1-F:5’-CGGAATTCATGGCAAAGTACACAAAAGAAGATA-3’反向引物Gln A-Stu 1-R:5’-AAGGCCTTTAATATTGGCTCATGTATTGGTCAC-3’上下游引物的5’端分别设计了 EcoR I和Stu I酶切位点用于连接到表达载体pET_41a，用含有酶切位点的引物扩增谷氨酰本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种谷氨酰胺合成酶基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种谷氨酰胺合成酶基因序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.一种基于巨大芽孢杆菌的谷氨酰胺合成酶外源表达方法，其特征在于，将测序得到的谷氨酰胺合成酶基因序列通过引物序列扩增并连接到表达载体中得到重组表达载体，并进一步将重组表达载体导入大肠杆菌中，筛选到含有目的基因的转基因重组菌。3.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的测序是指:以巨大芽孢杆菌NCT-2的基因组DNA为模板进行PCR扩增，然后将扩增产物进行电泳检测；并将扩增产物切胶回收后连接到pET-41a载体上进行测序。4.根据权利要求3所述的方法，其特征是，所述的PCR扩增采用的引物由:正向引物 Gln A-F: 5’ -ATGGCAAAGTACACAAAAGAAGATA-3’，以及反向引物 Gln A-R: 5' -TTAATAITGGCTCATGTAITGGTCAC-3’ 所组成。5.根据权利要求2所述的方法，其特征是，所述的引物序列扩增采用的引物为PCR扩增采用的引物的5’端分别设计了 EcoR I和Stu I酶切位点用于连接到表达载体，即:正...
【专利技术属性】
技术研发人员：周培，冯海玮，孙玉静，支月娥，刘群录，陆伟，时唯伟，卫星，初少华，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
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