本发明专利技术属于酶基因工程及酶工程领域，涉及一种邻硝基苯甲酸降解酶的编码基因及其应用。一种邻硝基苯甲酸降解酶的编码基因(基因nbaB)，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。一种所述的编码基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。本发明专利技术从Pseudomonas?sp.ONBA-17中克隆得到负责2-NBA代谢的基因片段——nbaB。本发明专利技术能够为2-NBA的降解提供有效的生物技术手段，对于2-NBA污染环境的修复具有重要意义。
Coding gene of ortho Nitrobenzene Degrading Enzyme and application thereof
The invention belongs to the field of enzyme gene engineering and enzyme engineering, and relates to a coding gene and an application of an enzyme for degrading formic acid. A coding gene (gene, nbaB) of an ortho - degrading enzyme of formic acid, whose nucleotide sequences are shown in SEQ, ID, No.1. A protein encoded by the coding gene, whose amino acid sequences, such as SEQ, ID, No.2, are shown. The present invention cloned the gene fragment responsible for 2-NBA metabolism from Pseudomonas sp.ONBA-17, nbaB. The invention can provide an effective biological technical means for the degradation of 2-NBA, and is of great significance for the restoration of 2-NBA polluted environment.
【技术实现步骤摘要】
一种邻硝基苯甲酸降解酶的编码基因及其应用
本专利技术属于酶基因工程及酶工程领域，涉及一种邻硝基苯甲酸降解酶的编码基因及其应用 。
技术介绍
随着我国化学工业的快速发展，有机合成所产三废(废水、废气、废渣)产生量呈逐年递增之势。上述三废中存在大量对生物体有毒害作用的物质，对环境造成了极为严重的污染和危害，威胁到人类和其它生物的安全和健康。其中，又以硝基芳香化合物的相关污染问题最为关出。硝基芳香化合物广泛存在于自然界中，主要应用于染料、杀虫剂、炸药、农药、医药及其它化工产品的生产。随着工农业的迅速发展，进入到环境中的硝基芳香化合物日益增多，给人类赖以生存的生态环境造成了严重的污染。此外，由于硝基和苯环结构的存在，使得硝基芳香化合物比其它化合物更难于生物降解。如何减少和去除此类化合物对生态环境的危害，已成为全社会共同关注的热点问题。邻硝基苯甲酸(2-NBA)是有机合成和制备染料、香料，润滑脂和润滑油的抗氧剂和金锈剂等的重要中间体，其工业需求量十分巨大。该物质对环境有危害，会对水体和大气造成污染，易在大气化学和大气物理变化中形成酸雨。当PH值降到5.0以下时，2-NBA会给动、植物造成严重危害，鱼的繁殖和发育会受到严重影响。此外，水体酸化还会导致水生生物的组成结构发生变化，耐酸的藻类、真菌增多，而有根植物、细菌和脊椎动物减少，有机物的分解率降低。如何高效、低成本，且环境友好的去除2-NBA颇具研究意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种邻硝基苯甲酸降解酶的编码基因(基因nbaB)。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是:一种邻硝基苯甲酸降解酶的编码基因(基因nbaB)，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。一种所述的编码基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。一种扩增所述的编码基因的引物，其核苷酸序列分别为SEQ ID N0.3和SEQ IDN0.4。含有本专利技术所述基因的重组载体。含有本专利技术所述基因的重组菌。含有以上任一所述基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本专利技术的保护范围。本专利技术从Pseudomonas sp.0NBA-17中克隆得到负责2-NBA代谢的基因片段——nbaB。本专利技术能够为2-NBA的降解提供有效的生物技术手段，对于2-NBA污染环境的修复具有重要意义。该菌是假单胞菌属(Pseudomonas sp.)的菌株0NBA-17,于2013年9月2日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCC N0.8095。保藏单位的地址为北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，该菌的分类命名为假单胞菌 Pseudomonas sp.。【附图说明】图1 是 Pseudomonas sp.0NBA-17 总 DNA(Genomic DNA)电泳检测图。【具体实施方式】下面通过具体实施例，对本专利技术的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本专利技术的实施并不局限于下面的实施例，对本专利技术所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本专利技术保护范围。在本专利技术中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所有的设备和原料等均可从市场购得或是本行业常用的。实施例1Pseudomonas sp.0NBA-17 总 DNA (Genomic DNA)的提取1.1Pseudomonas sD.0ΝΒΑ-17 的扩大培养在无菌操作环境下，将_70°C保存的Pseudomonas sp.0NBA-17以接种针挑取小块，放置、涂布于Luria-Bertani(LB)固体培养基之上。28°C，静置培养3d。挑选单菌落，经2次转接，观察发现平板上菌落形态一致(无杂菌)。这里所述的“平板”和Luria-Bertani (LB)固体/液体培养基等均为微生物研究/生产领域常见术语、培养基、技术和方法，具体参见《分子克隆实验指南》(J.萨姆布鲁克，等著.分子克隆实验指南(第三版)[M].黄培堂，等译.北京:科学出版社，2008)。下文中如无特别备注或说明，均为微生物研究常用技术、方法、 培养基、试剂和药品，且均在《分子克隆实验指南》中有所记录。1.2Pseudomonas sp.0NBA-17 总 DNA 的提取菌体总DNA的提取采用SDS高盐沉淀法。挑取LB平板上的单菌落，接至IOOmL的LB液体培养基培养至稳定期。离心收集菌体，加等体积的TEN溶液[IOmMTris-Cl (pH8.0), ImM EDTA(pH8.0), 0.1M NaCI]洗涤菌体，离心收集菌体，悬浮于 IOmLTE[IOmM Tris-Cl (ρΗ8.0), ImM EDTA(ρΗ8.0)]溶液中，加入 100 μ L 溶菌酶(100mg/mL)，37°C水浴 111，加入4(^1^蛋白酶1((2011^/1^)，再加入30(^1^20% (w/v% )的 SDS，37°C水浴过夜(约12h)。加入1/2体积饱和NaCl剧烈振荡，12000g离心IOmin,上清用等体积酚:氯仿抽提2次，12000g离心lOmin，收集上清，加入等体积TE溶液(稀释调整NaCl浓度)，0.6倍体积异丙醇沉淀，12000g离心15min，70% (v/v% )乙醇洗涤沉淀，乙醇挥发后溶于100 μ L TE 中。将提取到的菌体总DNA适当稀释后，经0.75% (w/v% )琼脂糖电泳检测其质量(如图1所示)，发现所提取的总DNA大部分集中在23kb左右，基本上没有RNA存在，纯度较好，浓度较高。实施例22-NBA降解酶编码基因nbaB的获得经过大量的分析实验，从28对自行设计的引物中筛选出一对有效扩增引物(分别记为 SEQ ID N0.3 和 SEQ ID N0.4)。nbaB-f, 5，~ACGACGAATTCATGAGTTACCAAAACTTAG~3，(下划线为 EcoRI 酶切位点，基因序列为SEQ ID N0.3)；nbaB-r，5，-CATTCATCTAGAGGAAGACCAGGAGC-3 ’(下划线为 XbaI 酶切位点，基因序列为 SEQ ID N0.4)。25μ L 扩增体系:10XTaq DNA 聚合酶反应缓冲液 2.5 μ L ;dNTP (25mM) 2 μ L ;引物(25pmol/ μ L)各 0.5 μ L ；Mg2+ 缓冲液(25mM) 2.5 μ L ;实施例1 中所得总 DNA0.5 μ L (约IOOng) ;Taq 酶(5U/μ L) 0.3 μ L ;ddH2016.2 μ L。反应参数:95 °C 预变性 5min，94 °C 变性30sec，52°C退火 30sec，72°C延伸25 个循环，最后 72°C终延伸 5min。扩增产物经0.75% (w/v% )琼脂糖电泳检测，发现扩增片段与预期大小(1.9kb左右)相符。切取含有nbaB基因扩增片段的凝胶，放入无菌1.5mL离心管中称重，使用B10MIGA胶回收纯化试剂盒进行目的片段回收，4°C保存备用。所得PCR产物参照《分子克隆实验指南》，进行TA克隆和后续操作，克隆用载体PMD19-T及相关试剂均购自宝生物生物技术有限公司(TaKaRa，大连)。挑取质粒经琼脂糖凝胶电泳验证插入片段大小正确后，挑取克隆子交上海生工测序。所得nbaB编码基本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种邻硝基苯甲酸降解酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种邻硝基苯甲酸降解酶的编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.—种权利要求1所述的编码基因所编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。3.扩增权利要求1所...
【专利技术属性】
技术研发人员：虞方伯，管莉菠，骆林平，单胜道，
申请(专利权)人：浙江农林大学，
类型：发明
国别省市：
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