本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒及其检测方法。本发明专利技术试剂盒包含PNA试剂，利用钳夹技术封闭野生型KRAS基因序列，从而提高sanger测序法的灵敏度和KRAS基因突变的检出率。本发明专利技术检测方法操作简单、安全，不需要较多昂贵试剂的使用，经济高效；同时还具有操作时间短的优点，整个检测过程可在4～6小时内完成。
【技术实现步骤摘要】
—种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒及其检测方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒及其检测方法。
技术介绍
RAS基因家族与人类肿瘤相关的基因有三种:HRAS、KRAS和NRAS，分别定位在11、12和I号染色体上。KRAS因编码21kD的ras蛋白又名p21基因。在RAS基因中，KRAS对人类癌症影响最大，它好像分子开关:当正常时能控制调控细胞生长的路径；发生异常时，则导致细胞持续生长，并阻止细胞自我毁灭。她参与细胞内的信号传递，当KRAS基因突变时，该基因永久活化，不能产生正常的RAS蛋白，使细胞内信号传导紊乱，细胞增殖失控而癌变。KRAS基因可以是正常状态(称为野生型)或异常状态(突变型)。正常生理情况下，在细胞受到外界刺激后激活生长因子等信号通路时，野生型的K-Ras被活性生长因子等酪氨酸激酶磷酸化后短暂活化，活化后的KRAS可以激活该信号通路中的下游信号蛋白，而后K-ras迅速失活。KRAS激活/失活效应是受控的。突变型K-Ras蛋白导致蛋白功能异常，在无生长因子活化信号刺激下仍处于激活状态，其功能状态不可控，导致肿瘤的持续增殖等。目前用于基因突变检测的方法有Sanger测序法、高效液相色谱法、实时荧光定量PCR法等。Sanger基因测序技术经过了 30年的不断发展与完善，现在已经可以对长达1，OOObp的DNA片段进行测序，而且对每一个碱基的读取准确率高达99.999%。由于具有很高的读取准确率，Sanger法测序成为基因突变、单核苷酸多态性等基因分析的金标准。肿瘤组织中，KRAS野生型细胞与突变型细胞混杂，而Sanger测序法的灵敏度仅为10~20%，即当突变型细胞占整体检测细胞的10~20%时才能检出，因此而极大的限制了Sanger测序法的应用。肽核酸(peptide nucleic acids, PNA) 一类以多肽骨架取代糖磷酸主链的DNA类似物。它是在第一代、第二代反义试剂的基础上，通过计算机设计构建并最终人工合成的第三代反义试剂，是一种全新的DNA类似物，即以中性的肽链酰胺2-氨基乙基甘氨酸键取代了 DNA中的戊糖磷酸二酯键骨架，其余的与DNA相同，PNA可以通过Watson-Crick碱基配对的形式识别并结合DNA或RNA序列，形成稳定的双螺旋结构。由于PNA不带负电荷，与DNA和RNA之间不存在静电斥力，因而结合的稳定性和特异性都大为提高；不同于DNA或DNA、RNA间的杂交，PNA与DNA或RNA的杂交几乎不受杂交体系盐浓度影响，与DNA或RNA分子的杂交能力远优于DNA/DNA或DNA/RNA，表现在很高的杂交稳定性、优良的特异序列识别能力、不被核酸酶和蛋白酶水解。并且PNA与互补DNA具有I个碱基不匹配时，其溶解温度会下降8 V~20°C，2个碱基不匹配时则完全不能杂交。鉴于上述诸多DNA分子不具备的优点，近十年来，人们为其在许多高
找到了用途。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的不足，提供一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒及其检测方法，本专利技术采用PNA钳夹技术封闭野生型BRAF基因序列，从而提高检测KRAS基因热点突变的敏感度和突变检出率。为解决上述技术问题，本专利技术通过如下技术方案实现:一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒，包括PCR反应液、PNA试剂、酶消化液、测序反应液、磁珠和产物纯化液，所述PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探针和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列为SEQ.1D N0.1，所述PCR反向引物的序列为SEQ.1D N0.2，所述探针的序列为SEQ.1D N0.3，所述探针的5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光基团为BHQl ;所述PNA的序列为SEQ.1D N0.4 ;所述测序反应液中含有Bi gdye、Bigdye缓冲液和测序引物。上述方案中，所述PCR缓冲液由100mmol/L Tris-HCl、500mmol/L KCl 和 15mmol/LMgCl2组成；所述dNTPs的摩尔浓度为2.5mmol/L dNTPs ;所述PCR正向引物的摩尔浓度为10 μ mol/L，所述PCR反向引物的摩尔浓度为10 μ mol/L ;所述探针的摩尔浓度为IOymol/L ;所述DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/ μ I ;所述PNA试剂的摩尔浓度为10 μ mol/L。上述方案中，所述酶消化液包括核酸外切酶I和碱性磷酸酶。上述方案中，所述核酸外切酶I和碱性磷酸酶的酶活力单位比为5:2。上述方案中，所述测序反应液含有5XBigdye、2.5XBigdye缓冲液和3 μ mol/L的测序引物。上述方案中，所述产物纯化液为0.75M氯化钠溶液。上述方案中，在所述PCR正向引物的5’端插入通用Ml3序列:TGTAAAACGACGGCCAGT，在所`述PCR反向引物的5’端插入通用Ml3序列:CAGGAAACAGCTATGACC，则所述的测序引物序列为:TGTAAAACGACGGCCAGT。一种利用上述试剂盒检测BRAF基因热点突变的方法，具体包括如下步骤:(I)目的基因荧光定量PCR扩增:使用试剂盒中荧光定量PCR反应液和PNA试剂，对样品DNA进行PCR扩增反应，得到目的基因的定量结果和PCR产物；(2)根据步骤(1)中的定量结果，使用试剂盒中的酶消化液，对步骤(1)得到的PCR产物进行纯化，得到纯化后PCR产物；(3)使用试剂盒中的测序反应液，对步骤(2)得到的纯化后PCR产物进行测序PCR反应，得到测序PCR产物；(4)使用试剂盒中的磁珠和产物纯化液，对步骤(3)得到的测序PCR产物进行纯化，得到纯化后测序PCR产物；(5)将步骤(4)得到的纯化后测序PCR产物加样至测序仪进行序列分析，测序所得基因序列与NCBI (美国国立生物技术信息中心)数据库中KRAS基因标准序列进行比对，并查看峰图，判断是否存在KRAS基因热点突变:若峰图中KRAS基因热点突变区域12位点GGT峰图下游典型的突变套峰，或者完全为突变峰图，可知样本中部分或全部细胞含有KRAS热点突变区域12位点。本专利技术的有益效果:(I)本专利技术试剂盒包含PNA试剂，在对样本DNA进行PCR扩增反应中，利用PNA试剂封闭野生型KRAS基因序列，提高sanger测序法的灵敏度和KRAS基因突变的检出率。(2)本专利技术检测方法操作简单、安全，同时不需要较多昂贵试剂的使用，经济高效。(3)本专利技术检测方法操作时间短，整个检测过程可在4~6小时内完成。【附图说明】图1为KRAS基因突变热点区域序列，其中下划线代表引物序列或引物结合位点，方框代表探针序列或探针结合位点，下划虚线代表PNA序列或PNA结合位点，斜体字母代表突变位点。 图2为实施例1中KRAS基因荧光定量PCR扩增曲线。图3为实施例1中KRAS基因测序图。【具体实施方式】为了更好地理解本专利技术，下面结合附图、表格、实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实例。实施例11、试剂盒中PCR反应液中的引物、探针序列的合成和PNA序列的合成根据KRAS基因热点突变区域和测序片段的要求(见图1)，设计如下引物本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、PNA试剂、酶消化液、测序反应液、磁珠和产物纯化液，所述PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探针和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列为SEQ.ID?NO.1，所述PCR反向引物的序列为SEQ.ID?NO.2，所述探针的序列为SEQ.ID?NO.3，所述探针的5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光基团为BHQ1；所述PNA的序列为SEQ.ID?NO.4；所述测序反应液包含Bigdye、Bigdye缓冲液和测序引物。
【技术特征摘要】
1.一种用于检测KRAS基因热点突变的试剂盒，其特征在于，包括PCR反应液、PNA试剂、酶消化液、测序反应液、磁珠和产物纯化液，所述PCR反应液包含PCR缓冲液、dNTPs、PCR正向引物、PCR反向引物、探针和DNA聚合酶，所述PCR正向引物的序列为SEQ.1D N0.1，所述PCR反向引物的序列为SEQ.1D N0.2，所述探针的序列为SEQ.1D N0.3，所述探针的5’端的荧光基团为FAM，3’端的荧光基团为BHQl ;所述？嫩的序列为SEQ.1D N0.4 ;所述测序反应液包含Bigdye、Bigdye缓冲液和测序引物。2.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于，所述PCR缓冲液由lOOmmol/LTris-HCl、500mmol/L KCl 和 15mmol/L MgCl2 组成；所述 dNTPs 的摩尔浓度为 2.5mmol/L dNTPs ;所述PCR正向引物的摩尔浓度为10 μ mol/L，所述PCR反向引物的摩尔浓度为ΙΟμπιοΙ/L;所述探针的摩尔浓度为10 μ mol/L ;所述DNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/μ I ;所述PNA试剂的摩尔浓度为10 μ mol/L。3.根据权利要求1所述试剂盒，其特征在于所述酶消化液包括核酸外切酶I和碱性磷酸酶。4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述核酸外切酶I和碱性磷酸酶的酶活力单位比为5:2。5.根据权利要求1所述试剂盒，其特...
【专利技术属性】
技术研发人员：叶伦，李雪梅，付金玲，陈刚，
申请(专利权)人：武汉康录生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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