基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒制造技术

本发明专利技术一种基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物与试剂盒，用于检测目的基因。本发明专利技术将TaqMan探针与LAMP技术相结合，从根本上解决了非特异扩增的问题，可以在等温条件下快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到目的基因，为核酸检测提供了新的技术平台，可用于基层医疗卫生单位和各疾病预防控制中心筛查和检测致病菌（如“超级细菌”等）等，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益，适于大范围推广应用。

Loop mediated isothermal amplification method based on TaqMan probe and its special LAMP primer and reagent kit

The invention relates to a loop mediated constant temperature amplification method based on a TaqMan probe and a special LAMP primer and a kit thereof for detecting the target gene. The TaqMan probe combined with LAMP technology, fundamentally solve the problem of nonspecific amplification, can be fast, convenient and efficient under isothermal conditions, high specificity and high sensitivity to detect gene, provides a new technical platform for the detection of nucleic acid can be used in basic medical and health units and the disease prevention and control center of the screening and detection of pathogens (such as \super bacteria\), has a broad market prospect and great economic and social benefits, is suitable for large-scale popularization and application.

【技术实现步骤摘要】
基于TaqMan探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引 物与试剂盒
本专利技术属于生物
中核酸的分子生物学检测方法，特别是涉及一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法及其在目的基因(核酸)检测中的应用。
技术介绍
实时突光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、不需要PCR产物后处理，有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。TaqMan荧光探针PCR技术是实时荧光定量PCR技术的一种，PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一条特异性的TaqMan荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5' — 3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。一分子的产物生成就伴随着一分子的荧光信号的产生。随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。因此，Taqman探针检测的是积累荧光。常用的荧光基团包括FAM、TET、VIC、HEX等。2000年Notomi在Nucleic Acids Res杂志上公开了一种新的基因诊断技术，即 LAMP (Loop-mediated isothermal amplification),中文名为“环介导等温扩增反应”，受到了世卫组织WHO、各国学者和相关政府部门的关注，短短几年，该技术已成功地应用于SARS、禽流感、HIV等疾病的检测中，在甲型HlNl流感事件中，日本荣研化学公司接受WHO的邀请进行H1N1LAMP试剂盒的研制。通过近十年的推广，LAMP技术已广泛应用于内各种病毒、细菌、寄生虫等引起的疾病检测、食品化妆品安全检查及进出口快速诊断中，并得到了欧美国家的认同。LAMP方法的优势除了高特异性、高灵敏度外，操作十分简单，对仪器设备要求低，一台水浴锅或恒温箱就能实现反应，结果的检测也很简单，不需要像PCR那样进行凝胶电泳，LAMP反应的结果通过肉眼观察白色浑浊或绿色荧光的生成来判断，简便快捷，适合基层快速诊断。LAMP与以往的核酸扩增方法相比具有如下优点:(I)操作简单，LAMP核酸扩增是在等温条件下进行，对于中小医院只需要水浴锅即可，产物检测用肉眼观察或浊度仪检测沉淀浊度即可判断。对于RNA的扩增只需要在反应体系中加入逆转录酶就可同步进行(RT-LAMP)，不需要特殊的试剂及仪器。(2)快速高效，因为不需要预先的双链DNA热变性.避免了温度循环而造成的时间损失.核酸扩增在Ih内均可完成，添加环状引物后时间可以节省1/2，多数情况在20-30min均可检测到扩增产物。且产物可以扩增至IO9倍，达0.5mg/mL.应用专门的浊度仪可以达到实时定量检测。(3)高特异性，由于是针对靶序列6个区域设计的4种特异性引物。6个区域中任何区域与引物不匹配均不能进行核酸扩增，因此其特异性极高。(4)高灵敏度，对于病毒扩增模板可达几个拷贝，比PCR高出数量级的差异。LAMP技术目前的检测方法主要为以下几种:一是普通电泳法，将LAMP扩增产物进行普通凝胶电泳，但此检测方法无特异性，因为只要发生了 LAMP反应，电泳条带均一样。二是荧光染色法，染料主要包括:SYBR Green 1、羟基萘酚蓝(HydroxynaphthoI blue, HNB),钙黄绿素。但是，SYBR Green I染料只要扩增出核酸便显示阳性，无特异性；羟基萘酚蓝与钙黄绿素均是指示LAMP的副产物镁离子的变化，也无特异性。三是浊度法，此法主要是检测LAMP的副产物焦磷酸镁，焦磷酸镁是一种白色沉淀，只要发生LAMP反应溶液即变浑浊，此法也无特异性。综合以上三种检测方法，均不能对扩增产物进行特异检测，均为间接检测，这也就带来了一个非常大的问题，如果LAMP发生了非特异性扩增，那么用这些检测方法获得的结果均是假阳性，因此，需要对LAMP技术进行改进，从根本上解决检测结果假阳性的问题。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术提供了一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法及其专用LAMP引物和Taqman探针。本专利技术所提供的LAMP引物，是首先从美国基因数据库GenBank检索获得待测目的基因的核苷酸序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到特异性的LAMP保守靶序列，再根据LAMP保守靶序列设计LAMP引 物。如图1所示，所述LAMP保守靶序列包括以下几个部分:F1_F3和B1-B3为引物设计区，Fl和BI之间为延伸区，引物设计区主要用于LAMP引物和Taqman探针的设计，延伸区也可用于Taqman探针的设计,但不是Taqman探针设计的优选区域。如图2所示，所述LAMP引物包括一条正向外引物F3、一条反向外引物B3、一条正向内引物 FIP (FIP=Flc+F2)、一条反向内引物 BIP (BIP=Blc+B2)。本专利技术还提供一种用在线LAMP引物设计软件设计LAMP引物的方法，是先登录LAMP 引物设计软件Primer Explorer V4 的在线网站(http://primerexplorer.jp/e/),然后导入LAMP保守靶序列，软件自动生成LAMP引物，该软件的具体使用方法，可包括以下步骤:I)单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认小于22kbp，支持三个类型的文件:普通文本格式(仅含序列)、FASTA格式和GenBank格式文件；2 )从下面三个选项中选择定参数设定条件(引物设计条件)，基于GC含量的自动判断，起始的参数是特定的:如果GC含量小于或等于45%，则选取AT丰度高的区，如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区，其它情况是标准设定状态；3)整理软件自动设计出的LAMP引物，合成引物。本专利技术还提供了一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法的专用Taqman探针，具体设计原则如下:I)探针位置尽可能地靠近LAMP保守靶序列的两端环状位置，具体的来说就是探针的位置在Fl和F3之间(将该探针命名为TF)，或者BI和B3之间(将该探针命名为TB)；2)探针长度应在15_45bp (最好是20_30bp)之间，以保证结合特异性；3)检测探针的DNA折叠和二级结构；4 ) Tm 值在 60-65 °C 之间，GC 含量在 40 % -70 % 之间；5)探针的5’端应避免使用G鸟嘌呤，因为5’G会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；6)整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量，因为G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；7)为确保探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计探针。此外，本专利技术所提供的TaqMan探针为经过荧光标记的，其5’端标记有报告荧光基团，3’端标记有淬灭荧光基团。 所述报告荧光基团可为FAM、HEX、TET、JOE、TAMRA, ROX, CY3、CY5 等，优选为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法的专用LAMP引物，是从美国基因数据库GenBank检索获得待测目的基因的核苷酸序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到特异性的LAMP保守靶序列，再根据LAMP保守靶序列设计LAMP引物。

【技术特征摘要】
1.一种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法的专用LAMP引物，是从美国基因数据库GenBank检索获得待测目的基因的核苷酸序列，通过BLAST软件进行同源性分析，找到特异性的LAMP保守靶序列，再根据LAMP保守靶序列设计LAMP引物。2.根据权利要求1所述的专用LAMP引物，其特征在于:所述LAMP引物包括一条正向外引物F3、一条反向外引物B3、一条正向内引物FIP (FIP=Flc+F2)、一条反向内引物BIP(BIP=Blc+B2)。3.根据权利要求1或2所述的专用LAMP引物，其特征在于:一种用在线LAMP引物设计软件设计LAMP引物的方法,是先登录LAMP引物设计软件Primer Explorer V4的在线网站(http: //primerexplorer.jp/e/),然后导入LAMP保守祀序列，软件自动生成LAMP引物，该软件的具体使用方法，可包括以下步骤: O单击浏览按钮选择靶基因序列文件，靶序列默认小于22kbp，支持三个类型的文件:普通文本格式(仅含序列)、FASTA格式和GenBank格式文件； 2)从下面三个选项中选择定参数设定条件(引物设计条件)，基于GC含量的自动判断，起始的参数是特定的:如果GC含量小于或等于45%，则选取AT丰度高的区，如果GC含量高于60%，则选取GC丰度高的区，其它情况是标准设定状态； 3)整理软件自动设计出的LAMP引物，合成引物。4.根据权利要求1或2或3所述的专用LAMP引物，其特征在于:当待测目的基因为NDM-1基因时，所述专用LAMP引物包括以下序列表示的引物组合: 正向外引物 CJXJ1F3:5’ -GCATAAGTCGCAATCCCCG-3’(序列表中序列 2)； 反向外引物 CJ XJ1B3:5’ -GGTTTGATCGTCAGGGATGG-3’(序列表中序列 3)； 正向内引物 CJXJ1FIP:5’ -CTGGCGGTGGTGACTCACGAAAAGCATGCAGCGCGTCCA-3’(序列表中序列4)； 反向内引物 CJXJ1BIP:5’ -CGCGACCGGCAGGTTGATCAAAAGGTCGATACCGCCTGGAC-3’(序列表中序列5)。5.—种基于Taqman探针的环介导恒温扩增法的专用Taqman探针,其设计原则如下: 1)探针位置尽可能地靠近LAMP保守靶序列的两端环状位置，具体的来说就是探针的位置在Fl和F3之间(将该探针命名为TF)，或者BI和B3之间(将该探针命名为TB)； 2)探针长度在15-45bp(最好是20-30bp)之间； 3)检测探针的DNA折置和二级结构； 4)Tm值在60-65°C之间，GC含量在40% -70%之间； 5)探针的5’端避免使用G鸟嘌呤； 6)整条探针中，碱基C的含量要明显高于G的含量； 7)将设计好的序列在...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘威，黄留玉，袁静，杨展，李环，崔茜，
申请(专利权)人：中国人民解放军疾病预防控制所，
类型：发明
国别省市：