对登革病毒血清型1E蛋白具有特异性的人单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术提供了用于治疗或预防脊椎动物受试者中的登革病毒感染的组合物和方法。特别是，公开了从EBV永生化的来源于已从登革感染中康复的患者的B细胞分离的抗登革病毒中和性人单克隆抗体。提供了以有效减轻、消除感染或预防感染复发的量向脊椎动物受试者施用此类抗体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对登革病毒血清型1E蛋白具有特异性的人单克隆抗体及其用途相关申请的交叉引用本申请要求于2010年12月14日提交的美国临时专利申请No.61/423,085的优先权，其公开内容为了所有目的特此通过引用全文并入。
本专利技术涉及抗登革病毒，特别是血清型1的人中和性单克隆抗体。本专利技术进一步涉及用于治疗或预防脊椎动物受试者中的登革病毒感染的组合物和方法。提供了以有效减轻、消除感染或预防感染复发的量向脊椎动物受试者施用抗体的方法。
技术介绍
登革热是最重要的影响人类的蚊媒病毒性疾病。目前，居住在热带/亚热带的超过100个登革热流行国家中的接近25亿人被认为具有登革热感染的风险。城市中栖息的蚊种埃及伊蚊(Aedesaegypti)是该病毒向人传播的主要传播者。登革病毒感染可导致一系列临床表现，其范围从无症状感染到登革热(DF)-一种急性热病，再到登革出血热(DHF)和登革休克综合征(DSS)-它们是严重的、危及生命的并发症，特点为血管外渗。当前的治疗局限于使用止痛药来减轻症状，而且没有可用的疫苗。登革热病每年影响五千万人，伴有频繁且反复发生的流行。虽然进行了严格的灭蚊，但20世纪90年代在世界上各个地区出现了登革热病的复发，以2005年在新加坡曾经出现的最大爆发达到顶峰。超过80％的报告病例是年轻成人，他们的工作能力受到相关影响，而且有显著的医疗保健费用用于他们的治疗。因此，迫切需要登革疫苗的替代选择，如被动抗体治疗和/或抗病毒药，以在当前时期帮助控制登革热相关疾病。这些提出的疗法具有帮助大批受感染个体的潜能，即使是仅应用于有发展为疾病严重形式的风险的个体(约占总数的10％)。随着登革热在发达国家如美国南部和澳大利亚的流行不断增加以及由于缺乏疫苗，这样的抗体将提供有用的药物治疗。本专利技术提供完全人单克隆抗体来满足这些及其它需求。
技术实现思路
本文描述了用于治疗或预防脊椎动物受试者中的登革病毒感染的组合物和方法。特别是，本文公开了由新近从登革血清型1感染中康复的患者产生完全人中和性单克隆抗体的例子。该抗体在体外和体内阻止登革血清型1感染方面显示出预防性和治疗性活性，并且可构成新药物治疗的基础。本专利技术使用从康复期患者制备永生化记忆B细胞的方法，包括从患者从感染中康复后60天采集的血样纯化其CD22阳性细胞。然后利用EB病毒(EBV)感染对纯化的B细胞进行永生化。该方法生成一组能够产生完全人抗体的永生化记忆B细胞系，可根据针对登革病毒的特异性来筛选这些抗体。这些B细胞系然后可以用作免疫球蛋白模板的富集来源用于鉴别和克隆在体外和体内对登革病毒具有中和活性的重组单克隆抗体。如本文所公开的，我们描述了对登革病毒血清型1具有特异性的第一种完全人单克隆抗体的分离、筛选、克隆和体外/体内表征。一个方面，本专利技术提供了与登革病毒血清型1包膜蛋白或其片段结合的分离的抗体或其片段，其中该抗体是具有中和活性的人抗体。在该方面的各种实施方案中，抗体或其片段可以是(a)完整的免疫球蛋白分子、(b)scFv、(c)Fab片段、(d)F(ab′)2或(e)二硫键连接的Fv。在其它实施方案中，抗体或其片段可包含选自下组的重链免疫球蛋白恒定结构域：(a)人IgM恒定结构域、(b)人IgG1恒定结构域、(c)人IgG2恒定结构域、(d)人IgG3恒定结构域、(e)人IgG4恒定结构域或(f)人IgA1/2恒定结构域。在再其它的实施方案中，抗体或其片段可包含轻链免疫球蛋白恒定结构域，该恒定结构域可以是：(a)人Igκ恒定结构域或(b)人Igλ恒定结构域。在另外的实施方案中，抗体或其片段包含重链，该重链包含至少一个选自图4(B)所示的CDR序列的CDR。在进一步的实施方案中，抗体或其片段包含轻链，该轻链包含至少一个选自图4(B)所示的CDR序列的CDR。在其它实施方案中，抗体或其片段包含重链，该重链包含三个如图4(B)所示的CDR序列。在其它实施方案中，抗体或其片段包含轻链，该轻链包含三个如图4(B)所示的CDR序列。在进一步的实施方案中，抗体或其片段包含IGHV1-2*02重链框架和至少一个如图4(B)所示的CDR序列。在再进一步的实施方案中，抗体或其片段包含IGKV3-20*01轻链框架和至少一个如图4(B)所示的CDR序列。在一个实施方案中，抗体包含图4(B)所示的重链序列。在另一个实施方案中，抗体包含图4(B)所示的轻链序列。在又另一个实施方案中，抗体是14c10，克隆8。在一些实施方案中，抗体或其片段以小于1×10-8M的亲和常数(KD)与抗原结合。在其它实施方案中，抗体或其片段以小于1×10-9M的亲和常数(KD)与抗原结合。在进一步的实施方案中，抗体或其片段来源于已从登革病毒感染康复的患者的B细胞。在进一步的实施方案中，抗体或其片段的结合跨越病毒中的两个包膜蛋白。在一些实施方案中，跨越两个包膜蛋白的结合包括与一个E蛋白上的DI以及DI与II之间的铰链以及相邻E蛋白的DIII结合。另一个方面，本专利技术提供一种结合登革病毒的抗体或其片段，其具有14c10克隆8的结合特异性。在进一步的方面，本专利技术提供一种有效减轻或预防受试者的登革病毒感染的药物组合物，其包含根据上述任一相关方面和实施方案的抗体或其片段以及药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药物组合物可进一步包含第二药剂，例如抗病毒药物或止痛药。在进一步的方面，本专利技术提供一种被动免疫的方法，其包括向受试者施用有效量的根据上述任一相关方面和实施方案的抗体或其片段。在另外的方面，本专利技术提供一种治疗登革病毒感染的方法，其包括向有需要的受试者施用有效减轻或预防该疾病的量的根据上述任一相关方面和实施方案的抗体或其片段。在一些实施方案中，抗体通过静脉内(IV)、皮下(SC)、肌肉内(IM)、透皮或口服施用。在其它实施方案中，抗体以1-100毫克/千克受试者体重的范围的量施用。这种施用可进一步包括第二药剂的施用，该第二药剂可以是例如抗病毒药物或止痛药。另一个方面，本专利技术提供一种产生抗登革病毒中和性抗体的方法，其包括：(a)确认新近从登革病毒感染中康复的个体；(b)从该个体获得B细胞；(c)对来自(b)的B细胞进行永生化；和(d)测定来自(c)的永生化B细胞的登革病毒中和作用。在该方面的实施方案中，B细胞是CD22+。在进一步的实施方案中，B细胞用EBV永生化。在其它方面，本专利技术提供一种分离的核酸，其编码根据上述任一相关方面和实施方案的抗体或其片段。这样的分离核酸可包含在表达载体中。这样的表达载体可包含在宿主细胞如细菌、真核或哺乳动物细胞内。附图说明图1：抗体筛选、表达和表征过程的流程图。从国立大学医院(NUH)接收的登革感染患者中分离CD22+B细胞。在为增强永生化效率而添加的多克隆B细胞激活剂(2.5μg/mlCpG序列、IL2和IL4)的存在下用EBV对这些B细胞进行永生化。B细胞以30个细胞/孔与1×105个从血沉棕黄层获得的已辐照的同种异体PBMC一起接种到96孔圆底孔中。两周后，通过ELISA、PRNT和CPE，针对结合/中和活性筛查来自这些克隆的上清液。提取阳性B细胞系的mRNA，将抗体的重链和轻链序列克隆到内部pCMV载体中，并转染到293F细胞中以产生高浓度的重组抗体。鉴别并进一步表征具有期本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种与登革病毒血清型1包膜蛋白或其片段结合的分离的抗体或其片段，其中该抗体是具有中和活性的人抗体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.12.14 US 61/423,0851.一种与登革病毒血清型1包膜蛋白或其片段特异性结合的分离的抗体或其片段，其中该抗体或其片段包含重链和轻链，该重链包含CDR序列SYGMH、VIWYDGSKTYYGDSVKG和GIAGGWAFW，且该轻链包含CDR序列RASQNVYSYLG、GVTSRAT和QQYAG。2.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中该抗体或其片段选自：(a)完整的免疫球蛋白分子、(b)scFv、(c)Fab片段、(d)F(ab')2和(e)二硫键连接的Fv。3.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其包含选自下组的重链免疫球蛋白恒定结构域：(a)人IgM恒定结构域、(b)人IgG1恒定结构域、(c)人IgG2恒定结构域、(d)人IgG3恒定结构域、(e)人IgG4恒定结构域和(f)人IgA1/2恒定结构域。4.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其包含选自下组的轻链免疫球蛋白恒定结构域：(a)人Igκ恒定结构域和(b)人Igλ恒定结构域。5.根据权利要求1-4任一项所述的抗体或其片段，其中该抗体或其片段包含IGHV1-2*02重链框架。6.根据权利要求1-4任一项所述的抗体或其片段，其中该抗体或其片段包含IGKV3-20*01轻链框架。7.根据权利要求1-4任一项所述的抗体或其片段，其中该抗体包含SEQIDNO：20的重链序列。8.根据权利要求1-4任一项所述的抗体或其片段，其中该抗体包含SEQIDNO：27的轻链序列。9.根据权利要求1所述的抗体或其片段，其中该抗体是14c10克隆8。10.根据权利要求1-4任一项所述的抗体或其片段，其中该抗体或其片段以小于1×10-8M的亲和常数与抗原结合。11.根据权利要求1-4任一项所述的抗体或其片段，其中该抗体或其片段以小于1×10-9M的亲和常数与抗原结合。12.根据权利要求1-4任一项所述的抗体或...

【专利技术属性】
技术研发人员：P·A·玛卡里，E·P·E·张，B·J·汉森，E·W·特奥，A·P·C·林，M·L·M·吴，S·M·洛克，P·E·库卡罗，
申请(专利权)人：新加坡国立大学，DSO国家实验室，
类型：
国别省市：