半乳糖凝集素3检测试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种半乳糖凝集素3含量检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、促凝剂、防腐剂、螯合剂、无机盐和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂和水。本发明专利技术采用粒径为130-270nm的胶乳颗粒通过化学交联法制备包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，能有效保证试剂盒的稳定性、灵敏度以及较宽的检测线性范围，具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适合于推广和应用。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种半乳糖凝集素3含量检测试剂盒及其制备方法。所述试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；其中，试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、促凝剂、防腐剂、螯合剂、无机盐和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂和水。本专利技术采用粒径为130-270nm的胶乳颗粒通过化学交联法制备包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒，能有效保证试剂盒的稳定性、灵敏度以及较宽的检测线性范围，具有稳定性好、灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适合于推广和应用。【专利说明】
本专利技术涉及半乳糖凝集素3含量检测试剂盒，尤其涉及一种人体内半乳糖凝集素3含量的检测试剂盒及其制备方法，本专利技术进一步涉及该检测试剂盒在检测人体内半乳糖凝集素3含量的使用方法，属于半乳糖凝集素3含量的检测领域。
技术介绍
Galectins,即β _半乳糖血凝素超家族,是一类I丐非依赖性的糖结合蛋白，具有高度保守性。目前，已发现该家族有14个成员，根据发现的先后顺序依次编号为1-14。Galectins家族的每个成员都具有以下特性:(I)具有特征性的氨基酸序列:每个Galectin家族成员至少包含一个由约130个氨基酸组成的糖识别结构域(CRD); (2)具有对β-半乳糖苷的亲和性。Galectin-3是Galectins家族唯一的嵌合体成员，由一个糖基与一个非糖基配体交联结合而成，分子量为32KD。在人类基因组中由单个基因编码，位于14号染色体q21_22位点，总长约17KD。Galectin-3包括3个结构域，NH2末端结合域，即I个糖结构识别域和I个特有的富含甘氨酸、脯氨酸和酪氨酸重复序列的结构域；NH2末端结合域包括控制细胞靶向的12个氨基酸残基，为与具有糖轭合物的细胞表面结合时发挥多种功能所必需；羧基末端的糖结合域可被胰蛋白酶裂解为包含140个氨基酸残基的糖结构识别域。根据Galectins的分子结构特点，可以将其分为3组:(1)原型，即含有一个CRD的单体，以单体(Galectin-5，-7，-10)或二聚体(Galectin-1，-2，-11，-13，-14)的形式存在；(2)嵌合体型，由一个糖基与一个非糖基配体交联结合而成(Galectin-3) ; (3)串联重复型，由两个CRD串联融合而成(Galectin-4, -6, -8, -9, -12)。作为一种多功能的蛋白，Galectin-3广泛分布于心脏、肾脏、肝脏、肺脏以及肠道等组织器官以及成骨细胞、上皮细胞和肠组织等各种组织和细胞中，并在激活的巨噬细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞等血液细胞中高表达。根据细胞类型，Galectin-3可存在于细胞浆、细胞核、细胞膜或细胞外基质，其在细胞内的分布依赖于细胞的增值状态。在静止期细胞，Galectin-3主要分布在胞衆；在增殖期细胞，Galectin-3主要分布在细胞核。Galectin-3可通过非经典分泌途径分泌到细胞外，与细胞表面受体和糖蛋白相互作用，参与跨膜信号转导。Galectin-3可参与细胞生长、细胞黏附、细胞凋亡、炎性反应、免疫调节、新血管形成、肿瘤分化转移等各种生理和病理过程。研究表明，Galectin-3作为一种重要的促有丝分裂原能在旁分泌方式下通过凝集素-碳水化合物相互作用来刺激肌成纤维细胞的增值和胶原合成。多项研究显示，随着心力衰竭程度的加重,血浆Galectin-3的表达水平呈逐步升高趋势，与健康对照组比较，差异具有统计学意义。心力衰竭组心功能III级、IV级患者血浆Galectin-3水平较健康对照组升高,提示Galectin-3水平的升高可能提示心力衰竭失代偿，可能成为评价心功能分级的新的生物学标志物和治疗新靶点。目前，Galectin-3常用的检测方法为酶联免疫法(ELISA)，酶联免疫法检测的准确度较高，但是检测过程繁琐，耗时较长且样本需要批量检测，不适用于及时检测。胶乳增强透射免疫比浊检测(PETIA)技术是在胶乳凝集定性试验基础上发展建立的一种非放射性均相免疫测定法，可以对各种微量的抗原物质和小分子半抗原进行精确的定量测定，目前越来越多的应用到临床实验室中。与ELISA技术相比，PETIA有效的提高检测速度和降低检测成本。然而，半乳糖凝集素3的定量检测分析需要较高的灵敏度，因此需要对PETIA技术参数进行优化以达到检测要求。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种稳定性好、灵敏度高、特异性强、操作简单、线性范围宽的半乳糖凝集素3含量检测试剂盒。本专利技术的目的之二是提供一种所述半乳糖凝集素3含量检测试剂盒的制备方法。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的:一种半乳糖凝集素3含量检测试剂盒，由彼此独立的试剂I和试剂II组成，所述试剂I的组分包括:生物缓冲剂、促凝剂、防腐剂、螯合剂、无机盐和水；所述试剂II的组分包括:包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂和水。本专利技术通过大量的实验发现，试剂II中胶乳颗粒的粒径对试剂盒的稳定性、灵敏度以及检测结果的准确性等有着非常显著的影响，本专利技术通过大量的实验最终确定，当选用的胶乳颗粒的粒径为130-270nm时，制备出的检测试剂盒的稳定性、灵敏度以及检测线性范围等特性要明显优于其它粒径的胶乳颗粒，尤其是当胶乳颗粒的粒径为200-210nm时，制备的检测试剂盒其各项性能最好。半乳糖凝集素3致敏胶乳颗粒可以采用化学交联法或物理吸附法等本领域的常规方法制备得到；本专利技术通过实验发现，采用化学交联法制备的致敏胶乳颗粒，抗体与胶乳颗粒通过化学键结合，从而使抗体不容易从胶乳颗粒上脱落下来，有利于维持试剂盒产品的稳定性，使产品的货架期能显著延长。优选的，一种制备包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒的方法，该方法包括以下步骤:(I)洗涤并活化胶乳；(2)抗体致敏胶乳；(3)封闭抗体致敏胶乳，洗涤，即得。其中，所述洗涤包括:取粒径为130-270nm的聚苯乙烯胶乳颗粒分散于MES缓冲液中(缓冲液中胶乳颗粒的浓度为0.5%-5%)，离心弃上清；所述的活化胶乳包括:将洗涤过的胶乳颗粒分散于MES缓冲液中(缓冲液中胶乳颗粒的浓度优选为0.5%-5%)，取碳化二亚胺和N-羟基硫代琥珀酰亚胺用MES缓冲液溶解后加入胶乳溶液中，混合均匀置于25-40°C恒温摇床上反应0.5-3h，得到活化的胶乳颗粒；所述抗体致敏胶乳颗粒包括:向活化的胶乳溶液中加入半乳糖凝集素3抗体，震荡混合均与，置于25-40°C恒温摇床上反应5-15h，即得；所述封闭胶乳颗粒包括:向致敏完成的胶乳颗粒溶液中加入甘氨酸溶液，混合均匀室温下静置反应15-80min后向体系中加入BSA溶液，混合均匀，室温下静置反应10_30min ；所述洗涤胶乳颗粒包括:将封闭后的胶乳颗粒离心，弃上清，用超纯水洗涤沉淀，即得。所述洗涤包括:取粒径为130_270nm的聚苯乙烯胶乳颗粒分散于MES缓冲液中，缓冲液中胶乳颗粒的浓度为0.5%-5%，离心弃上清。本专利技术半乳糖凝集素3单克隆抗体或多克隆抗体采用化学交联法包被胶乳颗粒，其中半乳糖凝集素3单克隆抗体或多克隆抗体能很好的识别样品中的半乳糖凝集素3抗原，从而能很好的提高检测试剂盒的特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种半乳糖凝集素3含量检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒由彼此独立的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ组成；所述试剂Ⅰ的组分包括：生物缓冲剂、促凝剂、防腐剂、螯合剂、无机盐和水；试剂Ⅱ的组分包括：包被半乳糖凝集素3抗体的胶乳颗粒、生物缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、助悬剂、封闭剂和水。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：华权高，许可，沈鹤霄，黄爱，来祥兵，伍卫姣，舒芹，
申请(专利权)人：武汉生之源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：