本发明专利技术公开了一种高产超氧化物歧化酶的重组菌及其应用。所述重组菌是在大肠杆菌（Escherichia?coli）菌株BW25113中导入重组质粒pBAD-SOD得到的重组菌；所述重组质粒pBAD-SOD是在原核表达载体pBAD/HisA的多克隆位点插入超氧化物歧化酶编码基因得到的。实验证明，利用本发明专利技术所提供的重组菌进行液体发酵后的发酵液中，超氧化物歧化酶酶活可达11000—11857U/mL,是对照菌的近1.6倍。本发明专利技术在超氧化物歧化酶的工业化生产及食品应用方面具有重要意义。
【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种高产超氧化物歧化酶的重组菌及其应用。所述重组菌是在大肠杆菌（Escherichia?coli）菌株BW25113中导入重组质粒pBAD-SOD得到的重组菌；所述重组质粒pBAD-SOD是在原核表达载体pBAD/HisA的多克隆位点插入超氧化物歧化酶编码基因得到的。实验证明，利用本专利技术所提供的重组菌进行液体发酵后的发酵液中，超氧化物歧化酶酶活可达11000—11857U/mL,是对照菌的近1.6倍。本专利技术在超氧化物歧化酶的工业化生产及食品应用方面具有重要意义。【专利说明】高产超氧化物歧化酶的重组菌及其应用
本专利技术涉及ー种高产超氧化物歧化酶的重组菌及其应用。
技术介绍
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)广泛存在于各类生物体中，是机体内超氧阴离子自由基的天然消除剂，对机体细胞起保护作用。因此，S0D在抗衰老以及预防肿瘤和抗炎等方面起着重要的生理作用，受到国内外医药日用化工，食品及生化界的极大关注。S0D在食品エ业主要应用四方面:1)作为保健食品的功效因子或食品营养强化剂，添加到各种食品中；2)制成多种剂型的S0D或复合型食品；3)用作食品的天然抗氧化剂；4)以富含S0D的原料加工制成保健食品。此外，S0D添加于化妆品中可起到防晒，防止脂褐素的形成，防治皮肤病以及防治瘢痕形成等作用。我国自上世纪八十年代以来，对S0D的应用研究主要侧重于动植物S0D的提取和纯化，国内产品大部分是从动物血液中制备的，但由于原材料有限及卫生安全性等原因，导致制品产量有限，且血液制品的安全性风险加大，这种方法慢慢的被淘汰。利用基因工程是广开S0D酶源，降低成本和获得具有天然活性的S0D有效途径。大肠杆菌K-12 (Escherichia coli K-12)品系被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物，国内已有用于食品生产许可的事例(如用大肠杆菌K12生产凝乳酶)。因此选用此系列囷株，能够保证食品安全性。目前，还没有利用大肠杆菌K-12品系高产超氧化物歧化酶的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供ー种高产超氧化物歧化酶的重组菌及其应用。本专利技术所提供的重组菌，是在大肠杆菌(Escherichia coli)菌株BW25113中导入重组质粒pBAD-SOD得到的重组菌；所述重组质粒pBAD-SOD是在原核表达载体pBAD/HisA的多克隆位点(即Nhel和PstI酶切位点间)插入超氧化物歧化酶编码基因得到的。在上述重组菌中，所述超氧化物歧化酶具体可为序列表序列1所示蛋白。在上述重组菌中，所述超氧化物歧化酶编码基因可为序列表序列2所示基因。所述重组菌具体可为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)BW-pBAD-SOD,已于2013年7月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCCN0.7934。本专利技术保护上述任一所述重组菌在生产超氧化物歧化酶中的应用。本专利技术还提供了ー种生产超氧化物歧化酶的方法，包括如下步骤:将上述任一所述重组菌进行液体发酵，得到所述超氧化物歧化酶；所述液体发酵按照包括如下步骤的方法进行:1)将所述重组菌接种至发酵培养基中，获得初始发酵体系；2)将所述初始发酵体系于30— 37°C (如30、33或37°C )条件下搅拌培养至发酵液中菌体OD600值为40—45 (如40、42或45);3)向发酵液中加入L-阿拉伯糖，于28— 30°C (如28、29或30°C )条件下搅拌培养;所述发酵培养基的溶剂为水，溶质及其在所述发酵培养基中的终浓度分别为:葡萄糖 10—20g/L (如 10,15 或 20g/L)，(NH4) 2HP044 — 8g/L (如 4、6 或 8g/L)，KH2P0413—13.3g/L (如 13 或 13.3g/L) , MgS040.59— 1.2g/L (如 0.59,0.9 或 1.2g/L),柠檬酸1.7—2.0g/L (如 1.7 或 2.0g/L)，FeS0454.67—109.35mg/L (如 54.67,85 或 109.35mg/L)，ZnS0410.22—11.5mg/L (如 10.22 或 11.5mg/L)，CuS043.2— 6.4mg/L (如 3.2、5.0 或6.4mg/L) , MnS043.2一5.4mg/L (如 3.2、4.3 或 5.4mg/L) , Na2B4070.8一1.22mg/L (如 0.8、1.0 或 1.22mg/L)，CaCl210—13.66mg/L (如 10、12 或 13.66mg/L)，(NH4) 6M070240.5—lmg/L (如 0.5、0.75 或 lmg/L)；所述发酵培养基的pH值为6.8—7.0 (如6.8,6.9或7.0)。在上述方法中，步骤3)中所述加入按每升所述发酵液中加入终浓度为1 一2g/L的所述L-阿拉伯糖进行。在上述方法中，步骤2)中的所述培养包括在发酵液中的葡萄糖耗尽吋，向所述发酵液中按200— 250mL/h的速率均速流加补料培养基的步骤；步骤3)中的所述培养包括向所述`发酵液中按300— 500mL/h的速率均速流加补料培养基的步骤；所述补料培养基的溶剂为水，溶质及其在所述补料培养基中的终浓度分别为:葡萄糖 600—800g/L (如 600,700 或 800g/L)，MgS047.3— 9.73g/L (如 7.3、8.3 或 9.73g/L), FeS04109.4— 2 1 8.8mg/L(如 109.4、169 或 218.8mg/L), ZnS0420.44一25mg/L(如 20.44、23 或 25mg/L)，CuS046.4—12.8mg/L (如 6.4、9.0 或 12.8mg/L)，MnS046.3—10.8mg/L (如6.3、8.4 或 10.8mg/L), Na2B407l.6一2.4mg/L (如 1.6、2.0 或 2.4mg/L), CaCl220一30.2mg/L (如 20、25 或 30.2mg/L)，(NH4) 6M070241 — 2mg/L (如 1、1.5 或 2mg/L)；所述补料培养基的pH % 6.8—7.0 (如6.8、6.9或7.0)。在上述方法中，步骤3)中所述培养的时间为6、7或8小时(如6、7或8小时)；和/或，步骤1)所述初始发酵体系中菌体的0D_值为1.3 — 1.5。在上述方法中，所述液体发酵的发酵液中溶氧量为20% — 30%体积百分浓度，pH值为 6.8—7.0。在上述方法中，步骤1)所述接种是通过将含有所述重组菌的种子液按照1: (9一19)(如1:9、1:14或1:19)的体积比接种至所述发酵培养基中实现；所述含有所述重组菌的种子液是将所述重组菌用如下种子培养基振荡培养制备得到的:溶剂为水，溶质及其在所述种子培养基中的终浓度分别为:蛋白胨10 — 16g/L (如10、13 或 16g/L),酵母膏 5—10g/L (如 5、8 或 10g/L),氯化钠 5—10g/L (如 5、8 或 1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种重组菌，是在大肠杆菌（Escherichia?coli）菌株BW25113中导入重组质粒pBAD?SOD得到的重组菌；所述重组质粒pBAD?SOD是在原核表达载体pBAD/HisA的多克隆位点插入超氧化物歧化酶编码基因得到的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：左德全，董志扬，何永志，姜广，董亮，蒋光明，
申请(专利权)人：北京奇化美生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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