一种戊二醛降解菌株及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种戊二醛降解菌株及制备方法和应用，其步骤：A、从猪场采集土样，加至装有无菌水的三角瓶中，摇瓶培养。B、3-5d后，取土壤溶液涂布在以戊二醛为唯一碳源的无机盐固体培养基上，恒温培养。C、将以戊二醛为唯一碳源的无机盐平板上生长的单菌落挑出，继续进行划线分离纯化，然后重新涂布到上述含戊二醛的无机盐平板上进行培养。经分离筛选后，获得对戊二醛具有稳定高效降解能力的菌株LP12，在LB斜面上保存备用。鉴定结果显示LP12为氮假单胞菌。利用LP12的生物降解作用能迅速清除环境中存在的戊二醛，填补了国内戊二醛污染土壤治理的一项空白。该菌株繁殖速度快，扩大培养需要的原料低廉，生产成本低，经济效益好，有广阔的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种戊二醛降解菌株及制备方法和应用，其步骤：A、从猪场采集土样，加至装有无菌水的三角瓶中，摇瓶培养。B、3-5d后，取土壤溶液涂布在以戊二醛为唯一碳源的无机盐固体培养基上，恒温培养。C、将以戊二醛为唯一碳源的无机盐平板上生长的单菌落挑出，继续进行划线分离纯化，然后重新涂布到上述含戊二醛的无机盐平板上进行培养。经分离筛选后，获得对戊二醛具有稳定高效降解能力的菌株LP12，在LB斜面上保存备用。鉴定结果显示LP12为氮假单胞菌。利用LP12的生物降解作用能迅速清除环境中存在的戊二醛，填补了国内戊二醛污染土壤治理的一项空白。该菌株繁殖速度快，扩大培养需要的原料低廉，生产成本低，经济效益好，有广阔的应用前景。【专利说明】一种戊二醛降解菌株及制备方法和应用
本专利技术属环境污染治理领域。具体涉及一种高效修复戊二醛污染土壤的菌株，同时还涉及一种高效修复戊二醛污染土壤的菌株的制备方法，还涉及一种戊二醛降解菌株在土壤环境治理中的用途。
技术介绍
戊二醛是一种五碳双缩醛化合物，广泛应用于手术器械的灭菌和环境物品的消毒及食品餐具的灭菌与消毒等领域(蒋合举等，2007)。由于戊二醛本身的内在毒性或使用不当而造成的健康危害时有发生。它对皮肤、粘膜与呼吸道有刺激、对部分人群有致敏作用，并可引发气喘和炎性或纤维性肺病。各国对工作场所戊二醛浓度都作出了极限规定。如美国工作场所临界极限为0.1ppm,英国定为0.05ppm (沈伟等,2008)。我国卫生部规定,接触皮肤或黏膜的消毒剂中戊二醛含量限制为1000mg/l (卫生部，2003)。此外，戊二醛在畜牧品方面所造成的生产和环境安全问题也很严重。作为一种畜牧生产领域常用的高效消毒剂，戊二醛在防治畜牧养殖常见病害的同时也造成了环境污染。残留在土壤中的戊二醛不仅抑制了病原微生物生长，有益微生物的繁殖和生长也受到影响(Dario Bonassi, 2003)。此外,残留的戍二醒还对畜牧产品安全构成极大的威胁。目前的环境治理主要是采用物理、化学或生物方法。化学处理方法会造成二次污染，物理吸附法仅仅是将戊 二醛转移到其它的载体上，并没有从根本上清除戊二醛。而生物降解方法可将戊二醛进行无害化转化，实现彻底降解。不过，目前戊二醛污染问题尚未得到足够重视，相关技术措施尤其是生物降解方法和技术手段还不成熟，尤其是戊二醛降解菌资源还相对有限，严重影响了利用生物降解技术处理污染土壤的效果。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种戊二醛降解菌株，该菌株不仅能耐受较高浓度的戊二醛，还具有高效降解戊二醛的能力，并且性能稳定，非常适合用于治理被戊二醛污染的土壤环境。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种戊二醛降解菌株的制备方法，该方法能在较短时间内大量获得优质高效的目的菌株，并且简单易掌握，成本低廉。本专利技术的再一个目的是在于提供了一种戊二醛降解菌株在戊二醛污染土壤治理中的应用，该应用能迅速、高效且彻底地降解污染土壤环境中的戊二醛，无残留，无二次污染。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施:一种戊二醛降解菌株的制备方法，其步骤是:I)从华中农业大学种猪场采集土样(任意取点)，称取IOg加至装有90ml无菌水的三角瓶中，摇瓶培养。2) 3 — 5d后，取100 μ I 土壤溶液涂布在以戊二醛为唯一碳源的无机盐固体培养基上，28 °C恒温培养。3)将以戊二醛为唯一碳源的无机盐平板上生长的单菌落挑出来，继续进行划线分离纯化，然后重新涂布到上述含戊二醛的无机盐平板上进行培养。经3次分离筛选后，最终获得对戊二醛具有稳定高效降解能力的菌株LP12，在LB斜面上保存备用。4)鉴定结果显示LP12为氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans),它是革兰氏阴性杆菌，不形成芽孢，化能有机营养，严格好氧，在LB培养基中IOh即可到达稳定期。 申请人:将上述分离得到的氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans) LP12于2012年4月24日送交中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为:CCTCCN0:M2012122。菌株LP12生物学和形态学鉴定①.生物学特征:杆状细菌，专性需氧，最适生长温度20°C~28°C，菌落圆形、表面光滑、凸起、湿润，浅黄色，有光泽，直径2~3nm。②.遗传学特性:LP12的16S rDNA序列为SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。NCBI`数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)进行序列分析结果显示该序列与氮假单胞菌的16Sr DNA序列具有97%的相似性，因此结合形态学观察和分子生物鉴定确认本专利技术所分离的戍二醒降解菌为氮假单胞菌(Pseudomonas azotoformans)。③.培养条件:分离筛选所用培养基为戊二醛培养基=C5H8O2 0.5mg/l、KNO3 1900mgl、NH4N031650mg/l、KH2PO4 170mg/l、MgSO4.7H20 370mg/l、CaCl2.2H20 440mg/l，自然 pH，121°C高压蒸汽灭菌30min。培养温度为28°C。保存活化以及收集该菌株所用培养基为LB培养基:胰化蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、NaCl 1(^/1，？!1为7.0~7.2，1211:高压蒸汽灭菌301^11。培养温度为28°C。④.功能特性:LP12具有对戊二醛的耐受性和高效降解性，对戊二醛最高耐受浓度为1.5% (V/V)，对戊二醛最高降解率可达到98.4%。一种戊二醛降解菌株在戊二醛污染土壤治理中的应用，其步骤是:I)检测污染土壤中戊二醛的初始浓度；2)将纯培养的降解菌，利用LB液体培养基在28°C，180rpm培养18h至稳定期；3)将扩大培养的菌液均匀撒在污染土壤表层；4) 48小时后，检测污染土壤中戊二醛浓度。本专利技术与现有技术相比，具有以下优点和效果:I)本专利技术填补了国内戊二醛污染土壤治理的一项空白；2)本专利技术利用微生物的降解作用来清除环境中存在的戊二醛，这种微生物降解方法可将戊二醛进行无害化转化，实现高效、迅速且彻底的降解，避免了物理治理方法的不彻底性或化学治理易造成二次污染等弊端。3)该菌株在实验室和土壤环境中，都保持着对戊二醛的高效降解能力，说明该菌株性能稳定，便于扩大生产和实际应用。4)该菌株繁殖速度快，扩大培养需要的原料低廉，生产成本低，经济效益好，有广阔的应用前景。【专利附图】【附图说明】图1为一种LP12菌株革兰氏染色的结果不意图。图2为一种LP12菌株的16srDNAPCR扩增结果的琼脂糖凝胶电泳分析示意图。图中:M:DNA分子量标准；1:空白对照；2 =PCR扩增产物。图3为一种LP12菌株的生长曲线示意图。图4为一种戊二醛含量与HPLC峰面积的标准曲线示意图。图5为一种在LB培养基条件下，LP12菌株对戊二醛的降解曲线示意图。图中:CK指示实验条件为添加相应浓度戊二醛的LB培养基；图6为一种在有菌土条件下，LP12菌株对戊二醛的降解曲线示意图。 图中:CK指示实验条件为添加相应浓度戊二醛的有菌土示意图。图7为一种在无菌土条件下，LP12菌株对戊二醛的降解曲线示意图。图中:CK指示实验条件为添加相应浓度戊二醛的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种戊二醛降解菌株，其特征在于：氮假单胞菌（Pseudomonas?azotoformans）LP12，CCTCC，?NO：M2012122。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈雯莉，黄巧云，骆萍，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：