蓝细菌生物合成乙醇的构建体、菌株与方法技术

本发明专利技术提供了一种在蓝细菌中高效生物合成乙醇的构建体，所述构建体包含与在蓝细菌中具有活性的启动子可操作地连接的第一基因和第二基因，其中所述第一基因选自丙酮酸脱羧酶基因，所述第二基因选自乙醇脱氢酶基因。本发明专利技术还提供了包含所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中高效生物合成乙醇的方法，其中所述蓝细菌已进行了基因改造从而能够产生乙醇。

【技术实现步骤摘要】
蓝细菌生物合成乙醇的构建体、菌株与方法
本专利技术涉及可再生能源领域和生物质能源领域。具体而言，本专利技术涉及用于在蓝细菌中高效生物合成乙醇的构建体，包含所述构建体的载体，包含所述构建体或用所述载体转化的蓝细菌，以及在蓝细菌中高效生物合成乙醇的方法，其中所述蓝细菌已进行了基因改造从而能够产生乙醇。
技术介绍
能源需求的持续加速增加与能源价格的不断攀升，石化能源供给不足以及大量使用石化能源所导致的环境污染与气候变化等问题，使得发展可再生替代能源迫在眉睫。生物燃料作为一种可再生替代能源是解决当前面临的诸多问题的重要手段之一。当前，以玉米或油菜等粮食作物为原料的第一代生物燃料发展路线由于“与人争粮，与粮争地”的问题，逐渐被摒弃。以非粮食作物为核心的纤维素乙醇与微藻生物柴油等“新一代生物燃料”正成为我国生物能源研究和发展的主流。纤维素乙醇的工艺路线“不与人争粮”，将农作物秸秆变废为宝，将其中的纤维素生物质水解为糖，然后再利用成熟的微生物乙醇发酵体系生产燃料乙醇，是一种非常有前景的生物燃料发展路线。但是其面临的主要瓶颈问题在于纤维素生物质高效降解、木质素分离以及五碳糖有效利用等三个方面。微藻生物柴油的工艺路线“不与粮争地”，在日照强烈的沙漠或海边大规模培养，再利用微藻体内大量积累的油脂，以生物或化学的办法使其与甲醇发生酯交换反应，生产脂肪酸甲酯(即生物柴油)，是一种极具前景的生物燃料发展路线。但是其面临的主要瓶颈问题在于微藻生物量积累与油酯积累不相统一，藻细胞的收集、脱水和酯交换反应副产物甘油的去除过程的能耗高等方面。总之，尽管纤维素乙醇和微藻生物柴油这两种重要的生物液体燃料发展路线都具有良好的发展前景，但是由于上述一些瓶颈问题的存在，生产成本大大增加，严重制约了其向产业化推广应用。蓝细菌(蓝藻，Cyanobacterium，Blue-greenalgae)是一类能够进行植物型产氧光合作用的原核微生物，它作为新一代能源微生物系统具有如下优势：(1)蓝细菌能够吸收太阳能、固定二氧化碳作为碳源进行自养生长，培养成本低；(2)蓝细菌是一类古老的微生物，已在地球上存在了几十亿年，它们对环境适应能力强，生长迅速；(3)蓝细菌遗传操作方便，遗传背景清晰，许多种类的基因组测序工作也已经陆续完成，这使得利用基因工程手段改造蓝细菌非常方便。其中，集胞藻(Synechocystissp.)PCC6803是单细胞蓝细菌的代表物种，其全基因组测序于1996年完成，是最早完成全基因组测序的光合微生物，也是目前研究最多的蓝细菌之一，被认为是生物燃料合成方面研究的理想的模式物种之一(Angermayr，S.A.等人，2009)。近年来，蓝细菌作为新一代能源微生物系统被用于生产生物燃料，正引起了学术界和企业界的广泛关注。国内外研究者相继提出了利用蓝细菌固定二氧化碳生产乙醇(DengandColeman1999，DexterandFu2009)、异戊二烯(Lindberg，Parketal.2009)、正丁醇(LanandLiao2011)和异丁醛(Atsumi，Higashideetal.2009)等生物燃料分子的新一代生物能源研究思路。与当前主流生物液体燃料研发路线相比，蓝细菌生物燃料是具有高的能量和碳转换效率、低能耗和低成本等优势，是一种更有前景的生物液体燃料研发路线。利用基因工程手段改造蓝细菌合成生物乙醇的研究工作，最早是由加拿大多伦多大学的Coleman教授课题组在1999年报道的。该课题组通过在聚球藻PCC7942中共表达来源于运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶，首次实现了乙醇在蓝细菌中的生物合成。傅鹏程在2009年报道了其在美国夏威夷大学工作期间在集胞藻PCC6803中开展的类似研究，将来源于运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶基因在集胞藻PCC6803中共表达，实现了太阳能到生物乙醇的转化。此外，位于美国佛罗里达州的Algenol生物燃料公司，从事利用蓝细菌生产乙醇方面的研究多年。本领域仍然需要具有高效合成乙醇的相关途径，大幅提高乙醇的产量的基因工程蓝细菌。
技术实现思路
本专利技术人首次成功地构建高效生物合成乙醇的蓝细菌所需的构建体和菌株，并验证该构建方法具有良好的可行性。相关术语在本专利技术中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的细胞培养、分子遗传学、核酸化学、有机化学等实验室操作步骤均为相应领域内广泛使用的常规步骤。同时，为了更好地理解本专利技术，下面提供相关术语的定义和解释。如本专利技术中所使用的，“蓝细菌(Cyanobacterium)”是一类光合自养的原核微生物，其能够利用太阳能，固定二氧化碳。蓝细菌也称为蓝藻。在本专利技术中，“蓝细菌”和“蓝藻”可互换使用。单细胞蓝细菌的代表物种是集胞藻PCC6803(Synechocystissp.PCC6803)。如本专利技术中所使用的，丙酮酸脱羧酶(pyruvatedecarboxylase，pdc)是能够催化由丙酮酸转化为乙醛的反应的酶。如本专利技术中所使用的，乙醇脱氢酶(alcoholdehydrogenase，adh)是能够催化由乙醛转化为乙醇的反应的酶。如本专利技术中使用的，rbc启动子(Prbc)是指集胞藻PCC6803基因组中编码催化光合作用中卡尔文循环的第一个反应的核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Ribulose-1，5-bisphosphatecarboxylase/oxygenase，Rubisco)的操纵子的启动子(SEQIDNO：1)。rbc启动子在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如SEQIDNO：1所示的序列。如本专利技术中所使用的，petE启动子(PpetE)是指编码质体蓝素(Plastocyanin，PC)的基因petE的启动子。质体蓝素是光合作用中将电子由细胞色素b6/f复合体传递到光系统I的电子载体。petE启动子在蓝细菌中具有活性，其例如可以具有如(NCBIID：NC_000911)公开的序列。如本专利技术中所使用的，slr0168基因(例如参见NC_954899)是集胞藻PCC6803基因组中编码一个未知功能蛋白的基因。前人的研究证明该基因的缺失对于细胞的生理活动没有影响，所以该基因所在的位置被认为是集胞藻PCC6803基因组中的一个中性位点(site)。如本专利技术中所使用的，slr1556基因(例如参见NC_952017)是集胞藻PCC6803基因组中编码乳酸脱氢酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。如本专利技术中所使用的，sll0945基因(例如参见NC_952804)是集胞藻PCC6803基因组中编码糖原合成酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。如本专利技术中所使用的，sll1393基因(例如参见NC_952566)是集胞藻PCC6803基因组中编码糖原合成酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量。如本专利技术中所使用的，slr1993基因(例如参见NC_954541)是集胞藻PCC6803基因组中编码乙酰辅酶A乙酰转移酶的基因，该基因的缺失可能会增加乙醇合成前体丙酮酸的积累量本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种构建体，其中，所述构建体包含与在蓝细菌中具有活性的启动子可操作地连接的第一基因和第二基因，其中所述第一基因选自：1)丙酮酸脱羧酶基因；2)其核苷酸序列与1)中的基因的序列具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因；和3)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与1)中的基因的序列杂交，并且编码具有丙酮酸脱羧酶活性的蛋白质的基因；以及其中所述第二基因选自：4)乙醇脱氢酶基因；5)其核苷酸序列与4)中的基因的序列具有至少80％同一性，优选地至少85％同一性，更优选地至少90％同一性，更优选地至少95％同一性，例如至少96％同一性，至少97％同一性，至少98％同一性，或至少99％同一性，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因；和6)其核苷酸序列在严紧杂交条件，优选高严紧杂交条件下能够与4)中的基因的序列杂交，并且编码具有乙醇脱氢酶活性的蛋白质的基因。

【技术特征摘要】
1.蓝细菌，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNO.5882或CGMCCN...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕雪峰，赵辉，谈晓明，范文俊，郑晓光，李志敏，高政绪，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，浙江齐成碳能科技有限公司，
类型：发明
国别省市：