哺乳动物多潜能干细胞外源基因高效转染及快速筛选制造技术

一种利用脂质体法将外源基因高效转染哺乳动物多潜能干细胞以及快速筛选转基因多潜能干细胞克隆的方法。该方法能够使外源基因高效转染哺乳动物多潜能干细胞，同时明显缩短筛选转基因多潜能干细胞的周期。获得的转基因干细胞能够保持多潜能状态。

【技术实现步骤摘要】
哺乳动物多潜能干细胞外源基因高效转染及快速筛选所属
本专利技术涉及一种利用脂质体法将外源基因高效转染哺乳动物多潜能干细胞以及快速筛选转基因多潜能干细胞克隆的方法。
技术介绍
目前，公知的利用脂质体法构建转基因细胞已经在科研、生产中广泛应用。但是，外源基因转染的受体细胞多为成体细胞而非多潜能干细胞。因而，利用公知的脂质体法操作规程转染哺乳动物多潜能干细胞会出现外源基因瞬时转染效率低，同时利用公知的转基因细胞筛选程序会造成转基因多潜能干细胞易发生分化、衰亡而导致外源基因转染失败。
技术实现思路
为了克服现有的脂质体法操作规程以及转基因细胞克隆筛选不适用于哺乳动物多潜能干细胞的不足，本专利技术提供一种利用脂质体法高效转染哺乳动物多潜能干细胞以及快速筛选转基因多潜能干细胞的方法。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：1外源基因高效转染哺乳动物多潜能干细胞采用脂质体法，在外源基因转染哺乳动物多潜能干细胞6小时后，用分别含有5％、15％胎牛血清的干细胞培养液培养36小时，而后换为15％胎牛血清的干细胞培养液。流式细胞仪对比检测外源基因的瞬时转染效率。2转基因多潜能干细胞快速筛选由于外源基因通常携带有Neor(neomycinresistance)新霉素抗性基因，可以通过一定浓度的G418抗生素杀死非转基因多潜能干细胞，从而筛选、纯化转基因多潜能干细胞。外源基因转染哺乳动物多潜能干细胞36小时后，以含有500μg/mLG418的干细胞培养液培养20小时，然后再以含有6mg/mLG418的干细胞培养液培养5小时。连续传2代，可获得纯化的转基因多潜能干细胞克隆。本专利技术的有益效果是，外源基因的瞬时转染效率由23.3％提高至69.17％，筛选周期由14天减少至25小时。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。图1是脂质体法介导的pCMV-DsRed转染哺乳动物绵羊羊水来源多潜能干细胞36小时后的流式细胞仪分析(a转染6小时后换为培养液II的绵羊羊水来源多潜能干细胞的外源基因瞬时转染率为23.3％，b转染6小时后换为培养液III的绵羊羊水来源多潜能干细胞的外源基因瞬时转染率为69.17％)。图2是6mg/mLG418筛选纯化转基因绵羊羊水来源多潜能干细胞(a为对照细胞的筛选(200×)，b为筛选纯化的转基因AFSC克隆(200×))。图3是RT-PCR分析转基因绵羊羊水来源多潜能干细胞标志基因表达情况(M为DL2000DNAmarker，1为Oct42为SSEA-1，3为MHC-II，4为GAPDH)。图4转基因绵羊羊水来源多潜能干细胞悬浮培养7天后形成的类胚体(a为普通光源下的类胚体(600×)，b为紫外光激发下的类胚体(600×))。具体实施方式首先，配制绵羊羊水来源多潜能干细胞培养液：培养液I：DMEM+1％L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸钠+微量β-巯基乙醇+5ng或500u/mLLIF+5ng/mLbFGF；培养液II：培养液I+15％FBS；培养液III：培养液I+5％FBS，用0.22μL的滤器过滤，4℃保存。图1中a、b外源基因的瞬时转染率获得的具体步骤为：参照LipofectamineLTXandPLUSReagents试剂盒(TAKARA)说明进行，主要步骤为，转染24h前，待转染AFSC干细胞胰酶消化重悬细胞，以5×104细胞/孔密度接种2×24孔板，使用培养液II，待细胞80％汇合度时，进行转染；转染前，AFSC用D-PBS洗三遍，换为Opti-MEM培养液于37℃5％CO2饱和湿度条件下培养30～40min；质粒DNA(350ng/μL)2μL+100μLOpti-MEM+0.7μLPlus，室温静置5min；添加2uLLTX，混均，室温静置30min后滴加入待转染的孔中，37℃5％CO2饱和湿度条件下培养4～6h后，其中一24孔板换为培养液III，另一24孔板换为培养液II。36h后换培养液II。同时，0.25％胰酶消化收集细胞，分别以未转染的AFSC为阴性对照，流式细胞仪测定基因转染的瞬时转染效率。(注：AFSC为羊水来源多潜能干细胞的英文缩写)图2中a、b获得的具体步骤为绵羊AFSC贴壁生长20h后，0.25％胰酶消化收集细胞以5×104细胞/皿密度接种在6cm培养皿中；浓度为500μg/mLG418的培养液II培养24h；浓度为6mg/mLG418培养液II培养5h；200倍显微镜下观察、拍照获得图2.a。绵羊AFSC转染36～48h后，0.25％胰酶消化收集细胞以5×104细胞/皿密度接种在6cm培养皿中；浓度为500μg/mLG418的培养液II培养24h；浓度为6mg/mLG418培养液II培养5h；胰酶消化收集细胞以5×103细胞/皿密度接种在6cm培养皿中。连续1∶2传代2次，200倍显微镜下观察、拍照获得图2.b。(注：AFSC为羊水来源多潜能干细胞的英文缩写)图3获得的具体步骤为1提取转基因AFSCtotalRNA当绵羊转基因AFSC贴壁生长汇合达到80％以上后弃上清，D-PBS洗3次；0.25％胰酶消化收集细胞至无酶EP管中，4℃，12000r/min×5min离心；弃上清，加入1mLRNAisoplus，反复吹打使细胞溶解，室温静置5min；加入0.2mL氯仿，充分震荡15s，待溶液充分乳化后，再室温静置5min；4℃，12000r/min×15min离心，吸取上层无色相；加等体积的异丙醇，混均，室温静置10min；4℃，12000r/min×10min离心，离心管底部出现沉淀；弃上清，沿离心管壁缓慢加入75％乙醇1mL，轻轻上下颠倒，4℃，12000r/min×5min离心，弃去乙醇，室温倒置于滤纸干燥2～5min；加入30～50μL无酶水充分溶解沉淀，测OD260、OD280，计算RNA纯度及完整性。2cDNA合成根据TaKaRa公司的PrimeScript1stStrandcDNASynthesiskit合成说明书合成cDNA。反转录反应液组分配置为：5×PrimeScriptBuffer，2μL；PrimeScriptRTEnzymeMixI，0.5μL；OligodTPrime(50μM)，0.5μL；Random6mers(100μM)，0.5μL；TotalRNA，3μL；RNaseFreewater补充至10μL。配置过程始终在冰上操作。反转录条件为37℃15min，85℃5sec。反应产物-20℃保存。3通过PCR方法检测以下基因的表达：Oct-4、SSEA-1、MHC-II等，内参为3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，引物信息见表1。PCR反应体系组成为：PremixExTaqVersion，12.5μL；primerupstream，0.5μL；primerdownstream，0.5μL；RNaseFree.dH2O补充至25μL。PCR反应循环参数为：95℃预变性5min；94℃变性30s；60℃，退火30s；72℃延伸30s；32个循环。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析并照相获得图3。(注：AFSC为羊水来源多潜能干细胞的英文缩写)表1RT-PCR引物序列及产物大小图4获得的具体步骤为取生长状态好，形态均一的第5代转基因A本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用脂质体法将外源基因高效转染哺乳动物多潜能干细胞以及快速筛选转基因多潜能干细胞克隆的方法。

【技术特征摘要】
1.一种利用脂质体法将外源基因高效转染哺乳动物多潜能干细胞的方法，其特征在于，(1)外源基因高效转染哺乳动物多潜能干细胞的方法步骤如下：配制绵羊羊水来源多潜能干细胞培养液：培养液I：DMEM+1％L-谷氨酰胺+1％非必需氨基酸+1％丙酮酸钠+微量β-巯基乙醇+5ng或500u/mLLIF+5ng/mLbFGF；培养液II：培养液I+15％FBS；培养液III：培养液I+5％FBS，用0.22μL的滤器过滤，4℃保存；所述脂质体法转染的步骤为：转染24h前，待转染绵羊羊水来源多潜能干细胞胰酶消化重悬细胞，以5×104细胞/孔密度接种2×24孔板，使用培养液II，待细胞80％汇合度时，进行转染；转染前，AFSC用D-PBS洗三遍，换为Opti-MEM培养液于37℃5％CO2饱和湿度条件下培养30～40min；350ng/μL质粒DNA2μL+100μLOpti-MEM+...

【专利技术属性】
技术研发人员：王凤武，荣威恒，李晓奇，詹树柏，达赖，赵世华，孙杰，羿静，
申请(专利权)人：内蒙古自治区农牧业科学院，
类型：发明
国别省市：